Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Апоптоз нормальных и трансформированных лимфоцитов при взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса in vitro

^ .Улч Па правах рукописи

КУДАГЯН Валим Маратович

АПОПТОЗ НОРМАЛЬНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТ ВИИ С ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ТИМУСА

1п у!(ГО

14.00.56 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации яа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1996 год

Работа выполнен» в Институте иммунологии Минздравмедпрома Российской

Федерации

Научный руководитель:

академик ЛЕН. докюр медицинских наук, профессор А.А.Ярилин

Официальные оппоненты:

член-Kopp. АБН, до»тор медицинских наук, профессор В.М.Земсхов доктор биологических наук Е.И.Асташкнн

Ведущая организации: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится 26 июня 1996 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Автореферат разосла н 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С.Сеславина

Актуальность темы

Поддержание гомеосгаза в макроорганизме достигается благодаря контролю над постоянными процессами пролиферации, дифференцировки и гибели соответствующих клеток. Понимание клеточной смерти как активного процесса, развивающегося в четком соответствии с заложенной в каждой клетке программой "самоубийства" привело к возникновению повышенного интереса к данному феномену в последние годы. Количество исследований, посвященных этому вопросу, растет лавинообразно, указывая на важность программной клеточной гибели или апоптоза в различных биологических процессах. Программная элиминация клеток играет важную роль в нормальном развитии тканей и органов в период эмбриогенеза, метаморфоза, гормон-зависимого тканевого роста и атрофии, в созревании лимфоцитов, а также в возникновенин и росте злокачественных новообразований.

Т-лимоциты играют ключевую роль в иммунном надзоре, то есть в распознавании и элиминации чужеродных или собстиеииых клеток, измененных вследствии опухолевой трансформации или инфицирования вирусами и другими внутриклеточными агентами. Осуществление этой роли достигается благодаря распознаванию Т-клеткамн модификации аутологичных молекул главного комплекса гнстосовместимосги вследствии их комплексирования с пептидными фрагментами чужеродных белков (вирусных, опухолеассоциированных и т.д.). Формирование способности Т-лимфоцитов распознавать свое и чужое и дифференцироваться в функционально-активные клетки происходит в тимусе благодаря процессам позитивной и негативной селекции (Ярилин и соавт., 199!, von Boehmer, 1994; Nossal, 1994). Данные процессы осуществляются под влиянием факторов микроокружения тимуса, под которыми понимают клетки, с которыми контактируют созревающие тимоциты и их гуморальные продукты (Kendall, 1991). К клеткам тимусною мнкроокружения относят эпителиальные, дендритные, миоидные клетки, макрофаг и, фибробласты и т.д. Важнейшими среди них считают эпителиальные клетки, которые вступают с тимоцитами в контакты и даже поглощают их внутрь и обволакивают отростками мембраны, а также выделяют ряд продуктов, как близкодействующих (цитокины), так и поступающих в кровоток (гормоны). Считается, что положительную селекцию тимоцитов осуществляют эпителиальные клетки тимуса, тогда как за осуществление

процессов элиминации потенциально аутореактогенных клонов предположительно ответственны дендритные клетки. Расшифровка сигналов, которыми обмениваются между собой эпителиальные клетки и тимоциты, позволит не только понять процесс развития Т-лимфоцитов, их функционального и клонального разнообразия, но и контролировать эти процессы и корригировать их в случае патологии.

Ранее в Институте иммунологии МЗ МП РФ была получена линия эпителиальных клеток из тимуса ребенка, получившая название HTSC (Sharova et all., 1993). Признаком эпителиальной природы является наличие в них кератина. Клетки HTSC экспрессируют на своей поверхности молекулы МНС I и II класса. В монокультуре они не пролиферируют и практически не выделяют гуморальных продуктов. При совместном культивировании с человеческими тимоцитами и активированными периферическими Т-лимфоцитами наблюдается активация клеток HTSC и секреция ими ряда цитокинов и гормонов тимуса, включая ai-тимозин. С другой стороны, в совместной культуре эпителиальных клеток и тимоцитов последние подвергаются апоптозу и исчезают к 3-4 суткам культивирования (Yarilin, Sharova, 1995). Можно предположить, что взаимодействие между эпителиальными клетками и Т-лимфоцитами in vitro моделирует аналогичные процессы, происходящие при селекции тимоцитов в тимусе in vivo, а данная система является удобной моделью для изучения гуморальных и клеточных сигналов и факторов, имеющих место при взаимодействии эпителиальных клеток тимуса и Т-лимфоцитов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ состояла в изучении на примере клеточной линии HTSC способности эпителиальных клеток тимуса индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и анализе природы контактных и гуморально-оносредованных сигналов, обусловливающих апоптоз тимоцитов и зрелых Г-лимфоцитов при их взаимодействии с эпителиальными клетками тимуса.

В соответствии с этой целью в работе решались следующие ЗАДАЧИ:

1. Анализ взаимодействия различных фракций тимоциюв с эпителиальной клеточной линией тимуса HTSC; установление взаимосвязи стадии дифференцировки тимоцитов и подверженности их апоптозу при взаимодействии с HTSC.

2. Анализ взаимодействия зрелых периферических лимфоцитов доноров с HTSC; эффективность митогенов различной направленности действия в индукции апоптоза активированных лимфоцитов эпителиальными клетками тимуса.

3. Изучение иозможносш индукции апоптоза трансформированных лимфоцитов больных лимфолейкозами и перевиваемых клеточных линий при взаимодействии с ШЪС.

4. Изучение роли Газ-антигена в НТЗС'-индуцнрованном апоптозе лимфоцитов.

5. Анализ значения контактных и гуморальных взаимодействий между тнмоцитами и клетками НГ8С в индукции апоптоза тнмоцитов; роль пар молекул С04-МИС-П; С13К-МНС-1, С02-С05Н; ЬРА-1-1САМ-1 в НТЗС-опосредованном апоптозе.

6. Ингибиторный анализ Н'18С-индуцированного апоптоза; эффект ингибиторов синтеза ДНК, РНК, белка, блокаторов микротрубочек и микрофиламентов.

7. Сопоставительный анализ апоптоза, вызванного клетками НТБС и другими факторами (облучением, глкжокортнкоидамн).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ: Впервые исследовано взаимодействие лимфоидных и эпителиальных клеток тимуса в культуре с выяснением природы сигналов, обусловливающих индукцию апоптоза первых и активацию последних, а также анализом некоторых механизмов этих процессов. Данная работа вносит свой вклад в понимание природы процессов развития Т-кдеток (в частности, селекции тимоцнтов и некоторых возможных механизмов, способных индуцировать программированную гибель периферических Т-лимфоцитов), взаимодействий между эпителиальными и лимфоидными клетками, особенностей сигналов, приводящих к активации и апоптозу клеток, соотношения контактных и гуморальных факторов в их осуществлении.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ: Работа вносит существенный вклад в развитие общей иммунологии, а также медицины, обогащая их пониманием нскоюрмх этапов развития Т-клсток и особенностей взаимодействия последних с эпителиальными клетками тимуса.

Сделаны первые шаги в понимании природы сигналов, способствующих индукции апоптоза в трансформированных Т-лимфоцитах, что может явиться основой для дальнейшего изучения сигналов и факторов, способствующих данному процессу, и иметь важное практическое значение для возможности использования этих факторов в терапии лимфолейкозов.

Разработанная тест-система in vitro может быть использована при тестировании активности препаратов, в том числе для оценки действия фармакологических агентов на развитие лимфоцитов в тимусе, чувствительность Т-клеток к индукции апоптоза и выработку гормонов и цитокинов эпителиальными клетками.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Эпителиальные клетки тимуса линии HTSC вызывают апоптоз предшественников Т-лимфоцитов (дубль-негативных (CD4-CD8-) и дубль-позитивных (CD4+CD8+)) и не вызывают апоптоз зрелых (CD4-CD8+ и CD4+CD8-) тимоцитов.

2. Клетки HTSC индуцируют апоптоз активированных периферических Т-лимфоцитов доноров, лимфоцитов больных Т-лимфолейкозами и клеток перевиваемых Т-клеточных линий.

3. Супернатанты от активированных HTSC вызывают апоптоз тимоцитов и Т-лимфоцитов.

4. Моноклональные антитела (МоДт) к CD95 (Fas, АРО-1), экспрессированному на поверхности тимоцитов и активированных Т-клеток, индуцируют апоптоз этих клеток; предварительная обработка МоАт к CD95 Т-клеток ведет к блокаде HTSC-индуцированного апоптоза последних.

5. МоАт, блокирующие взаимодействие между парами молекул LFA-1/1САМ-1 и CD8/MHC-I на поверхности тимоцитов и эпителиальных клеток соответственно ведут к отмене HTSC-опосредованиого апоптоза.

6. Ингибиторы синтеза ДНК, РНК и белка блокируют HTSC-индуцированный апоптоз.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Диссертация апробирована на заседании секции N2 Ученого Совета Института иммунологии. По материалам работы опубликовано печатные работы.

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, содержит рисунка и таблицы. В списке литературы источника, из них - отечес твенных анюрон.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Линия эпшелиальнмх клетк стромы тимуса человека (HTSC) была любезно предоставлена к.б.н., ведущим научным сотрудником лаборатории дифференцировки лимфоцитов Института иммунологии МЗ МП РФ Н.И.Шаровой.

Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли из гепаринизированной венозной крови на градиенте плотности фиколла-верографина ("Pharmacia") центрифугированием при 400g в течение 30 мин. Клеточную суспензию забирали из интерфазы и трижды отмывали средой 199 по 10 мин при 200g. Клетки ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из среды RPMI 1640 ("Flow Labs") с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи), 2 мМ L-глутамина, 20 мМ HEPES ("Flow Labs") и 80 мкг/мл гентамицмна ("Pharmachim").

Источником тнмоцитов служили дольки тимуса, удаленные в ходе сердечно-сосудистой операции для облегчения доступа к сердцу у детей не старше 5 лет. Дольки тимуса измельчали в гомогенизаторе, эритроциты и нежизнеспособные клетки удаляли центрифугированием на градиенте фиколла-верографина как описано выше, клеточную суспензию ресуспендировали в ПКС.

Для фракционирования тнмоцитов нами использовался классический метод пеннинга (отрицательная селекция) с некоторыми модификациями. Селекцию проводили на пластиковых чашках Петри диаметром 90 мм ("Медполимер"). Использовали среду 199 с 0.2% ЭТС для уменьшения неспецифической адгезии. Принципиальная схема фракционирования представлена на рис 1.

В чацпси Петри вносили по S-8 мл кроличьей антисыворотки против иммуноглобулинов мыши в 0,) М бикарбонатом буфере (рН 8,6) (концентрация белка составляла 25-50 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 4° С или при 37° С в течение 1 часа, удаляли антисыворотку, дважды ополаскивали чашки и вносили по 5 мл среды с ЭТС на 30 мин при комнатной температуре для снижения неспецифической адгезии клеток. По истечении срока, вносили 4-5 мл клеток в концентрации 2-4* Ю'/мл. Клетки предварительно обрабатывали мышиными МоАт против поверхностных маркеров, согласно схеме на рис. 1 в течение I часа при 4° С (рабочее разведение антител 1:200 на 5*10* клеток). Чашки Петри с клеточной суспензией инкубировали 40-45 мин при комнатной

Рис. 1

Схема негативной селекции тимоцитов

легкая фракция (р= 1,066) обогащенная кортикальными тимо(|пастами

обработка МоАт к CD3, CD4, CD8

I

адгезия

CD3-CD4-CD8-ДН тимоцнты

ТИМОЦИТЫ

обработка МоАт к CD3

адгезия

CD4+CD8+ ДП тимоциты

обработка МоАт к CDI адгезия

медуллярные щмоциты CDI-

обработка МоАт к CD4

1

адгезия

I

CD4-CD8+ СП тимоциты

обработка Мо/^т к CDS

адгезия

CD4+CD8-СП тимоциты

температуре, периодически помешивая их круговыми движениями, для полноты связывания. Неприлипшие клетки удаляли, осаждали центрифугированием при 200g 10 мин и ресуспсндировали в ПКС. Чистоту фракционирования определяли цитометрически.

Поверхностные антигены лимфоцитов определяли методом проточной цнтометрин с помощью набора МоАт. Выделенные и отмытые клетки доводили до концентрации I * I06, вносили в лунки круглодонных 96-луночных планшет по 50 мкл. К клеточной суспензии добавляли соответствующие МоАт в рабочем разведении 1:10 н инкубировали 30 мин при температуре 4°С. Далее клетки отмывали трижды средой 199 с 1% азидом натрия ("Sigma") центрифугированием в течение 5 мин при 200 g, вносили ФИТЦ-коньюгат козьих антител против иммуноглобулинов мыши и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали трижды, ресуспендировали в 1% параформальдегиде и хранили до цитометрии. Цитометрию проводили на проточном цнтометре Epics Profile II ("Becton Dickinson").

Для индукции апоптоза в тимоцитах и МНПК клеточной линией HTSC клетки культивировали в соотношении 1*107/1 * 10s соответственно в чашках Петри диаметра 40 мм в течение 18 часов, собирали, центрифугировали, удаляли супернатант. Клеточный осадок хранили замороженным при -70" С до выделения ДНК.

В качестве положительного контроля в некоторых опытах использовали образцы тимоцитов, обработанных дексазоном ("Galénica") в концентрации 10 мкг/мл в течение 18 ч для индукции апоптоза.

ДНК выделяли из клеюк по методу, описанному Perandones С.Е. el all., 1993 с некоторыми модификациями. 'Замороженные клетки ресуспендировали в буфере 10 мМ трис-НС1-ЭДТА ("Sigma") pH 7,4, содержащем 0,2% тритона Х-100 ("Merk") (ТЕ-буфер), центрифугировали при 13000 об/мин 15 минут для отделения низкомолекулярных фрагментов ДНК от нефрагмеитированной ДНК. Супернатант, содержащий фрагментированную ДНК, отбирали в эпендорфы и преципитировали 50% изопропиловым спиртом в присутствии 0,5 М хлорида натрия в течение ночи при -20" С. Преципитаты центрифугировали при 13000 об/мин и 4° С для осаждения ДНК, которую затем хранили в 80% этаноле при -20° С до электрофореза.

Преципитированную ДНК освобождали от этанола высушиванием, растворяли в 20 мкл ТЕ-буфера и добавляли 5 мкл буфера, содержащего 50% глицерина / I мМ ЭДТА (pH 8.0)/ 0,25% бромфенолового синего. Пробы нагревали в течение 10 мин на водяной бане при 60° С и вносили в сухие лунки 1% агарозного геля (агарозу расплавляли в течение 40 мин при 100° С в трис-ацетатном буфере pH 8,0 (ТАЕ-буфер), перед полимеризацией в гель добавляли 10 мкл бромистого этндия ("Sigma") исходной концентрацией 10 мг/мл. Электрофорез проводили в ТАЕ-буфере при напряжении 70 V и силе тока 60 мА в течение 1-3 часов. Гель проявляли подсветкой УФ-лучами на

трансиллюминаторе и фотографировали.

Для анализа контактных взаимодействий между тимоцитами и клетками HTSC тимоциты обрабатывали МоАт к CD4 и/или CD8; CD2 (ТОО "Сорбент") или LFA-I ("МедБиоСпектр"), а клетки HTSC - анти-МНС-1 и/или анти-МНС-Н; анти-ICAM-l МоАт (любезно предоставлены д.м.н. А.В.Филатовым) в течение I часа при 4°С с целью блокады соответствующих поверхностных структур, отмывали и культивировали для индукции апоптоза.

С целью блокады синтез белка клетки (I*l0VMfl) инкубировали с циклогексимидом ("Serva") в концентрации 20 мкг/мл в течение 3 чисов при 37° С в СОг-инкубаторе, после чего отмывали трижды средой 199 центрифугированием при 1500 об/мин по 5 мин, ресуспендировали в ПКС и культивировали как описано выше. Для блокады синтез РНК клетки инкубировали с актиномицином Д ("Boeringer") в концентрации 2 мкг/мл, условия инкубации были теми же.

С целью блокады микротрубочек и, таким образом, нарушения миграции клеток использовали колхицин ("Serva") в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Клетки в концентрации 1*10®/мл инкубировали в ПКС с колхицином в течение 3 часов в атмосфере COj-иикубатора, отмывали трижды средой 199 по 5 мин центрифугированием при 1000 об/мин, ресуспендировали в ПКС.

Биолюминесцентный метод определения АТФ в лимфоцитах был разработан нами в 1994 году. Клеточные культуры вносили в лунки 24-луночных планшет в концентрации 1*10' в мл и инкубировали в течение суток в присутствии HTSC (1*105/мл) или дексазона 10 мМ/мл. Через каждые три часа проводился анализ уровня внутриклеточного АТФ, для чего из лунок отбирали 100 мкл клеточной суспензии и фиксировали в 100 мкл ДМСО. Измерение АТФ проводили на люминометре ЛБ-ЗП (МП "Климби"). В полистироловую кювету вносили 500 мкл АТФ-реагента "Иммолюм", содержащего люциферии, люциферазу светляков, ионы Mg++. Измеряли фоновое свечение (Ii), в ту же кювету вносили 100 мкл клеточной суспензии, фиксированной ДМСО и измеряли интенсивность свечения образца (Ь). Затем с целью внутренней калибровки вносили 10 мкл АТФ-стандарта в концентрации 10~5 М/мл и измеряли интенсивность свечения стандарта (Ii)- Концентрацию АТФ рассчитывали по формуле:

Ii - I.

[АТФ]=----------------• 2 * 10 15 М/мл

h - I:

Концентрацию внутриклеточного АТФ рассчитывали на клетку, деля полученное значение на количество клеток в I мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Одним из наиболее достоверных критериев процесса апоптоза в настоящее время является межнуклеосомная фрагментация клеточной ДНК на участки длиной 160-200 пар оснований либо кратные им, происходящая вследствии активации Са++/Му++-зависимой эндонуклеазы. Межнуклеосомную деградацию ДНК можно зарегистрировать методом электрофореза в агарозном геле с последующей визуализацией в УФ-лучах; при этом имеет место характерная картина чередования светлых и темных участков, соответствующих фрагментам ДНК одинаковых размеров и межнуклеосомным промежуткам (так называемая

"ДНК-овая лестница"). Данный метод использовался в качестве основного для регистрации апоптоза в исследуемой системе.

Первоначально важно было подобрать условия совместною культивирования HTSC и тимоцитов, при которых наибольшее число клеток подвергалось бы апоптозу одновременно, а морфологические изменения в клетках были бы наиболее выражены. Как известно, время от момента действия стимула, вызывающего апоптоз, до развития в клетке морфологических изменений по разным наблюдениям колеблется от 3 до 18 часов. В отличие от классических стимулов, вызывающих апоптоз (ионизирующее излучение, действие глюкокортикоидов), при которых клетки входят в апоптоз синхронно, мы имели дело с моделью взаимодействия клеток двух видов, один из которых в результате этого взаимодействия подвергался апоптозу. Соотношение клеток в культуре 104/10! (HTSC/тимоциты), предложенное Н.И.Шаровой и соавт., было достаточным, чтобы вызвать пролиферацию HTSC и синтез гормонов ими, но недостаточным для того, чтобы в течение 18 часов большинство тимоцитов подверглось апоптозу. Поэтому мы увеличили концентрацию HTSC на порядок до I05 на I07 тимоцитов для того, чтобы воздействие HTSC на тимоцнты и картина апоптоза в системе были более выраженными.

На рис. 2 показана динамика прироста HTSC и исчезновения тимоцитов при их совместном культивировании.

При взаимодействии дубль-негативных (ДН) и дубль-позитивных (ДГ1) тимоцитов с HTSC наблюдается апоптоз этих клеток (рис. 3), более зрелые сингл-позитивные (СП) тимоцнты не подвергались HTSC-индуцированному апоптозу. Таким образом, HTSC способны вызывать апоптоз предшественников Т-лимфоцитов и незрелых тимоцитов и не оказывают существенного влияния на зрелые клетки.

Представлялось интересным изучить изменение фенотипа ДН клеток при культивировании с HTSC. Возможно, HTSC представляют собой аналог тимических клеток-нянек и способны вызвать дифференцировку ДН тимоцитов. Изменение экспрессии поверхностных маркеров на ДН тимоцитах представлено на рис. 4.

Исходная экспрессия маркеров на ДН тимоцитах незначительна, при совместном культивировании в течение 24 часов с HTSC наблюдается увеличение

культурах этого не происходило). Тем не менее к третьим суткам культивирования происходит снижение числа положительных по данным маркерам клеток. ДМ клетки, как показано выше активно подвергаются апоптоэу при контакте с HTSC и, возможно предварительно часть клеток успевает дифференцироваться в ДП (следующая стадия развития тимоцитов), которые затем уже подвергаются апоптозу. Можно п))едположить, что для дальнейшего развития ДП тимоцитам необходимы другие стимулы со стороны клеток микроокружения, позволяющие им выжить и дифференцироваться в более зрелые. В нашем же случае мы имеем дело с эпителиальными клетками, на которых имеется присущий только им набор антигенных детерминант, в частности, молекул главного

комплекса гистосовместимости, контакт с которыми считается необходимым условием селекции тимоцитов in vivo. Учитывая, что HTSC и тимоциты заведомо

Апопто) различных фракций тимснцггов в присутствии IITSC

1 2 ЪА 5

I- нефракционированные тимоциты, 2 - ДН тимоцнты, 3 - ДП тимоциты, 4 - СП (CD4+CD8-) тимоциты, 5 - СИ (CD4-CDS+) тимоциты

Рис. 4

не соответствуют друг другу по молекулам главного комплекса гистосовместимостн в силу различных источников этих клеток, можно предположить отсутвне со стороны первых стимулирующих и поддерживающих сигналов последним - процесс, в норме соответсвующий позитивной селеции тнмоцитов.

МНПК использовались нами в нескольких вариантах: неактивированные, в литературе называемые покоящимися, resting клетки; активированные ФГА в течение 24 часов, активированные ФГА в течение 72 часов (бластные клетки); активированные ФГА в течение 72 часов и культивированные в присутствии рекомбинантного ИЛ-2 в течение еще 3 суток (краткосрочная культура).

МНПК культивировали в присутствии HTSC в соотношении 107107 в мл в течение 18 часов и определяли фрагментацию ДНК, данные представлены на рис. 5. Как видно из фотографии, в отсутствие HTSC фрагментации ДНК в МНПК не наблюдалось. Покоящиеся клетки были устойчивы к HTSC-индуцированному апоптозу в отличие от активированных лимфоцитов, которые подвергались апоптозу. Визуально все бластные клетки на 2-3 сутки были окружены пролиферирующими HTSC, динамика исчезновения бластов напоминала таковую тимоцитов. Для подтверждения факта исчезновения именно CD3+ лимфобластов мы проанализировали поверхностные маркеры оставшихся клеток после контакта с HTSC. Через 3 суток инкубации с HTSC, когда большинство клеток исчезает, остаются преимущественно В-лимфоциты и моноциты, что свидетельствует в пользу вовлечения в апоптоз именно активированных Т-лимфобластов.

ФГА является классическим митогеном, вызывающим переход клетки из Go-фазы клеточного цикла в Gi, а затем в S-фазу с последующей пролиферацией; таким же свойством обладает митоген лаконоса (МЛ). Кроме того, существуют вещества, активирующие лимфоциты, но не вызывающие их переход в S-фазу цикла. К таким агентам относят форболовые эфиры, в частности форбол-миристат-ацетат (ФМА) и ионофор кальция А23187. Данные клеточные активаторы представляли интерес в отношении развития активационно-опосредованного апоптоза лимфоцитов в системе с HTSC.

HTSC вызывали апоптоз МНПК, активированных МЛ, и не влияли на лимфоциты, активированные ФМА или ионофором кальция. Данные результаты согласуются со способностью МЛ, подобно ФГА, вызывать пролиферацию

Апоптоэ МНПК доноров в присутствии НТБС

¿2345 6

1 - положительный контроль; 2 - МНПК, активированные 3 суток ФГА и культивированные еще 3 суток в присутствии ИЛ-2; 3 - МНПК, активированные 3 суток ФГА, 4 - МНПК, активированные I сутки ФГА, 5 - неактивированные МНПК, 6 - контроль МНПК (активированные ФГА без НТБС)

МНПК с образованием бластных клеток, что делает их подверженными к НТЭС-индуцированному апоптозу. Действие же ионоофора кальция, который не вызывает пролиферацию лимфоцитов, не вело к НТБС-опосредованному апоптозу клеток, активированных данным препаратом. По-видимому, одного повышения кальциевого потенциала не достаточно для появления чувствительности лимфоцитов к НТЗС-индуцнрованному апоптозу. Добавление ФМА в культуру МНПК в присутствии моноцитов само по себе являлось достаточным для последующей индукции апоптоза части лимфоцитов, что находит подтверждение в литературе. Сочетанное же дейывие ФМА, активирующего протеинкиназу С и НТЭС вело к исчезновению апоптоза Т-лимфоцитов в системе. Вероятно, предварительная активация ироюинкипиш С, имеющая место в данном случае, является достаточной для отмены НТЗС-индуцированного апоптоза.

Представлялось интересным изучить взаимодействие лимфоцитов периферической крови больных острыми, нелеченными лимфолейкозами, среди которых наибольший интерес представляли Т-лимфолейкозы. Так как эти клетки

изначально находятся в состоянии постоянной пролиферации и процент бластных клеток в крови этих больных является достаточно высоким, мы сочли целесообразным исследовать их взаимодействие с НТБС без предварительной активации лимфоцитов. Поскольку случаи нелеченной. клинически развернутой картины ОЛЯ достаточно редки, мы имели возможность изучить только три случая Т-ОЛЛ и один случай острого миелобластного лейкоза (ОМЛ).

Во всех трех случаях Т-ОЛЛ лимфоциты подвергались апоптозу при совместном культивировании с НТБС; лимфоциты больного миелолейкозом апоптозу не подвергались. На рис. 6 представлены результаты исследования этих больных. Контролем служили интактные лимфоциты данных больных, культивированные в отсутствие НТБС.

Рис. 6

Апоптоз лимфоцитов больных Т-ОЛЛ и МБЛ в присутствии НТвС

А. в. С. А. I 2 14 112 2

м* •» г».

— 1

I

А. С. Д. - лимфоциты больных Т-ОЛЛ; В. - лимфоциты больного МБЛ; 1-контроль; 2 - МНПК в присутствии НТЯС

Данные об успешном НТ5С-нндуцированном апоптозе лимфобластов больных Т-ОЛЛ позволили сделать предположение о возможной индукции апоптоза перевиваемых клеточных линий при совместном культивировании с НТБС. В качестве таких линий нами были выбраны Т-лимфобластная клеточная линия ¿игка!, являющаяся к тому же СОЧ5+. СПУ5- Т-лимфобластная линия

MOLT-4, EBV-трансформированная В-лимфобластная линия Raji и миелобластная линия К562 для сравнения.

Клетки HTSC вызывали апоптоз клеток линии Jurkat, но в связи с тем, что пролиферативный потенциал этих клеток слишком высок, при смешивании клеток в обычном соотношении (10VI07) мы не смогли зарегистрировать четкой картины межнуклеосомной деградации ДНК. Увеличение процента апоптоэных клеток нивелировалось крайне быстрым размножением клонов. Только при сочетании клеток в соотношении 1:1 мы наблюдали характерную фрагментацию ДНК. Клетки линий MOLT-4 и Raji были устойчивы к HTSC-индуцнровагаюму апоптозу. В конечном итоге в обоих случаях мы получали смешанную клеточную культуру, в которой благополучно размножались клетки двух линий. Клетки линии К562 подвергались апоптозу на вторые сутки взаимодействия с HTSC.

Важную роль во взаимодействии между дифференцирующимися тимоцитами и эпителиальными клетками в тимусе играют прямые межклеточные контакты. В связи с этим, мы проанализировали роль различных пар молекул на поверхности контактирующих клеток в процессе индукции апоптоза тимоцитов в данной системе.

Эпителиальные клетки тимуса экспрсссируют молекулы адгезии LFA-3 (CD58) и ICAM-I, которые связываются с CD2 и LFA-1 соответственно. В дополнении к этому эпителиальные клетки экспрессируют на своей мембране молекулы главного комплекса гистосовместимости I и II классов, взаимодействующие соответственно с молекулами CD4 и CD8 на поверхности тимоцитов, что играет важную роль в становлении зрелого Т-клеточного репертуара.

Клетки HTSC подвергали мягкой фиксации 1% параформальдегидом без последующего разрушения и делали попытку индукции апоптоза тимоцитов фиксированными клетками. Данные клетки вызывали апоптоз тимоцитов аналогично нефиксированным, что подтверждает важность контактных взаимодействий между тимоцитами и HTSC.

Для оценки значения взаимодействий пар молекул CD2/CD58(LFA-3) и LFA-1 (CD 11 a/CD 18)/ICAM-1 тимоциты обрабатывали МоАт к CD2 и CD18 ф-субъединице LFA-1), a HTSC - МоАт к ICAM-I (МоАт к комплексу CD58 у нас отсутствовали). Результаты последующего культивирования обработанных клеток представлены на рис. 7. Как видно из представленных данных, анти-С02 МоАт

сами индуцировали ипоптоз тимоцитов (что не противоречит данным зарубежных исследователей), но не отменяли апоптоз, индуцированный HTSC; индукция апоптоза была получена и при использовании анти-С018 МоАт. Обработка клеток HTSC анти-ICAM-l МоАт вела к отмене апоптоза тимоцитов.

Клетки линии IITSC также обрабатывали неполиморфными антителами к МНС I (HLA А, В, С) и/или II (HLA-DR) классов, экспрессированным на их поверхности; тимоциты, в свою очередь, обрабатывали антителами к CD4 и/или CD8 и инкубировали» в смешанной культуре для индукции апоптоза. Как видно из рис. 7, обработка тимоцитов анти-С04 МоАт или клеток HTSC анти-МНС-П МоАт не оказывала влияния на последующую индукцию апоптоза в тимоцитах; при взаимодействии тимоцитов с анти-CDS или HTSC с MHC-II МоАт наблюдалось ингибирование апоптоза в системе. Аналогичная картина наблюдалась при действии смеси антител к CD4 и CD8 на тимоциты или MHC-I и MHC-II на HTSC. Эти результаты указывают на важность взаимодействия пары молекул CD8/MHC-I для индукции апоптоза.

МоАт к молекуле CD3 на поверхности тимоцитов сами индуцировали апоптоз и не влияли на HTSC-опосредованный апоптоз.

Для оценки роли гуморально-опосредованноой составляющей взаимодействия клеточной линии HTSC с тимоцитами в индукции их апоптоза к интактным тимоцитам добавляли супертанант от активированных HTSC (HTSC культивировали в присутствии тимоцитов в течение 5-6 суток) - неразведанный, а также 75%, 50%, 25% (на ПКС). Отрицательным контролем служили тимоциты, к которым добавляли соответствующее количество ПКС. Положительным контролем являлись тимоциты, культивированные в присутствии HTSC. Добавление супернатантов от HTSC во всех разведениях являлось достаточным для индукции апоптоза тимоцитов.

Представлялось интересным изучить роль CD95 (Fas/APO-l - рецептор, экспрессирующийся на поверхности клеток и способный индуцировать их апоптоз при связывании со своим лигандом). Сами анти-С095 МоАт вызывали апоптоз тимоцитов, причем часовой инкубации клеток с антителами было достаточно для индукции апоптоза а них. При обработке HTSC с последующей инкубацией с интактными тимоцитами ингибирования апоптоза не наблюдалось. Обработка тимоцитов aHTH-CD95 антителами в обоих случаях (сочетание с обработанными или интактными HTSC) вела к отмене апоптоза в клетках. Данные представлены на рис. 8.

Роль контактных взаимодействий в индукции апоптоза тимоцитов клетками HTSC

А. I-тимоциты-контроль, 2-tmmouhtu+HTSC; В. тимоциты+HTSC, обработанные

1-анти-МНС-1, 2-анти-МНС-И, З-анти-МНС-I и II; С. HTSC+тимоциты, обработанные 1-анти-С08, 2-анти-С04, 3-анти-С04 и CD8; D. тимоциты, обработанные МоАт согласно п. С без HTSC; Е. тимоциты, обработанные анти-CD2 1-без HTSC, 2-+HTSC; F. тимоциты, обработанные анти-CDie 1-без HTSC,

2-+HTSC; G. 1-HTSC, обработанные анти-1САМ-1+тимоциты, 2-HTSC, обработанные контр. МоАт +тимоциты

Вероятно, при апоптозе тимоцитов в нашей системе мы имееем дело с двумя различными сигналами, оба из которых по отдельности способны вызывать гибель клеток, но при совместном действии апоптоз тимоцитов блокируется.

Поскольку супернатант от активных HTSC вызывал апоптоз тимоцитов, интерес представляла возможность блокировать этот процесс анти-С095 МоАт. Предварительная обработка тимоцитов анти-С095 МоАт с последующим добавлением супернатанта не вела к блокированию апоптоза тимоцитов. Можно предположить, что в данном случае мы наблюдаем аддитивность сигналов от

анти-Рая антител и от апоптогенных веществ, имеющих место в супериатантах активных НТБС, оба из которых по отдельности также вызывают апоптоз тимоцитов.

Рис.8

Влияние анти-С095 МоАт на НТвС-ивдуцированный апоптоз тимоцитов

1 а Ъ А 5 6

1- НТЗС, обработанные анти-С095 МоАт + интактные тимоциты; 2 - тимоциты, обработанные анти-С095 МоАт + интактные НТБС; 3 - сочетанная обработка тимоцитов и НТБС анти-С095 МоАт; 4 - тимоциты, обработанные анти-С095 без НТЭС; 5 - тимоциты - контроль; 6 - тимоциты + НТБС

Учитывая важность нормальной экспрессии С1395 на поверхности клеток для развития активационно-индуцированного апоптоза, мы решили изучить активированные ФГА МНПК больных системной красной волчанкой (СКВ), у большинства которых в сыворотке которых имеет место растворимая форма данного рецептора, появившаяся вследствии отсутствия трансмембранного домена и способная в различной степени блокировать нормальный процесс апоптоза через этот рецептор. МНПК больных СКВ предварительно активировали ФГА в течение 72 часов с последующим добавлением НТ5С, аналогично активированным МНПК здоровых доноров. В восьми случаях из 9

лимфоциты больных СКВ были резистентными к НТБС-нндуцированному апоптозу; в одном случае апоптоз в системе имел место. Нам представляется более вероятным, что отсутствие апоптоза МНПК при взаимодействии с НТБС, имевшее место в большинстве случаев, является следствием низкого

пролиферативного потенциала этих клеток и малого количества бластных форм через 72 часа от начала активации.

Для индукции апоптоза клетка на определенном этапе осуществляет макромолекулярный синтез, для которого характерен высокий уровень транскрипции и трансляции, появляются синтезированные de novo ферменты, принимающие участие в индукции клеточной гибели (в частности эндонуклеаэа, осуществляющая разрушение ДНК до фрагментов, соответствующих по размерам нуклеосомам). Впервые важность макромолекулярного синтеза в процессе апоптоза была показана благодаря использованию ингибиторов транскрипции и трансляции. Однако, имеются работы, указывающие на то, что не любая форма апоптоза может быть блокирована данными ингибиторами: например, Fas-индуцированный апоптоз по многим данным нечувствителен к ингибиторам макромолекулярного синтеза. С этой точки зрения нам представлялось интересным изучить вдияние ингибиторов синтеза белка и РНК на апоптоз тимоцитов, индуцированный HTSC.

В качестве ингибитора синтеза белка был выбран циклогексимид-антибиотик, полностью блокирующий синтез белка за счет подавления функции цитохромоксидазы. Кроме того, циклогексимид угнетает процессы пиноцитоза, распластывания и цитотоксичности.

В качестве ингибитора синтеза РНК был использован актиномицин Д (дактиномнцин, актиномицин С) - антибиотик, связывающийся с дезоксигуаниловыми группами ДНК и нарушающий таким образом действие фермента РНК-полимеразы и блокирующий образование РНК.

Кроме блокады синтетической функции клеток, представлялось интересным изучить влияние препаратов, блокирующих функции микротрубочек и микрофиламентов, которые в конечном итоге приводят к нарушению миграции клеток и размножения. Действие цитохалазина В основано на дезинтеграции микрофиламентов и нарушении миграционных свойств клеток. Под действием колхицина происходит нарушение процессов полимеризации микротрубочек с последующим их разрушением, происходит блокада пролиферации в метафазе и нарушение миграции клеток.

Влитие на НТвС-лндуцяромяные алоптоз ингибиторов клеточных

^ функций £ 3 4 12 5 4 12

А Е.

Клетки обрабатывали препаратами: А. циклогексимид; В. колххицин; С. Ахтиномицин Д. 1 - НТБС, обработанные препаратами + интактные тимоциты; 2 -тимоциты, обработанные препаратами + интактные НТ5С; 3 - тимоциты и НТСС,обработанные препаратами; 4 • тимоциты, обработанные препаратами в отсутствии НТБС, Д. необработанные тимоциты + НТБС; Е. интактные тимоциты.

Как видно из результатов, представленных на рис. 9, сами антибиотики не вызывали апоптоз тимоцитов. При предварительной обработке препаратами НТ5С ингибирования апоптоза не наблюдалось. При обработке тимоцитов препаратами наблюдалось выраженное ингибирование апоптоза в присутствии интактных или обработанных НТБС.

Поскольку процессы активации и апоптоза во многом схожи (начиная от общих пусковых стимулов, кончая экспрессией общих генов), представлялось интересным изучить динамику изменения внутриклеточного АТФ в процессе апоптоза тимоцитов, вызванного классическим апоптогенным стимулом - воздействием дексазона, и НТБС. Клеточные культуры культивировали в течение суток, уровень внутриклеточного АТФ измерялся в ходе инкубации каждые три часа. Результаты представлены на рис. 10.

0,8 0,7

Изменение внутриклеточного АТФ при апоптоэе тимоцитов

0 £

5 06 а

в5°'5 И

| 0.3 +

1 0,2

х о

* 0,1 о

■ -контроль

...д. - дежсаэон

- -кгес

в 9 12 время, часы

При сравнении динамики изменения внутриклеточного ЛТФ в процессе взаимодействия тимоцн'ов с Н'ГБС имело место незначительное повышение уровня АТФ в первые часы с последующим плавным его снижением. Кривая динамики изменения А IФ при воздействии дексазона имела резкий подъем к третьему часу воздейа шя (напоминающий таковой при активации Т-клеток митогенами) с послед» ющим постепенным снижением концентрации ниже исходного уровня.

Представлялось ичк-ресным изучить действие ионизирующего излучения и ипококортикоидных гормонов на лимфоциты в сочетании с НТвС. МНПК здоровых доноров ПОДН1 "1.1ЛИ деИспшю понтирующего излучения в 1, 4 и Я Гр, и затем инкубировали в те юние часов в присутствии НТБС или без них. Апото! в необлученных, покомп чхся лимфоцитов в присутствии или отсутствии НТБС не наблюдался. При облуч> ши в I Гр наблюдалась незначительная деградация ДНК, соответствующая апот чу. При увеличении дозы облучения апоптоз МНПК также увеличивался. Г1р1 сочетанием действии облучения и НТБС вдозах 1 и 4 Гр наблюдалось усиление ."юшоза, при облучении 8 Гр - свойственная апонтозу

межнуклеосомная деградация ДНК исчезала, и появлялась картина, предположительно характерная для некроза - массивный шмер распадающейся ДНК.

Поскольку тимус является местом синтеза глюкокортикоидных гормонов и пи гормоны играют важную роль в созревании лимфоцитов, мы изучили совместное действие различных доз дексаэона и HTSC на тимоциты. При сочетании субоптимальных доз дексазона (0,1-1 мкг/мл) с действием HTSC наблюдалось усиление апоптоза тимоцитов. Более высокие дозы дексазона не оказывали влияния на апоитоз в системе.

Эпителиальные клетки тимуса являются уникальными в своей способности предоставлять стимулирующие сигналы развивающимся тимоцитам в процессе позитивной селекции. При этом показана возможность тимических клеток-нянек, имеющих эпителиальное происхождение, при определенных условиях индуцировать апоптоз дифференцирующихся тимоцитов вследствин взаимодействия рецепторов на поверхности этих клеток. Данный процесс может включать взаимодействие между Т-клеточным рецептором тимоцита с соответствующим комплексом МНС I или II класса на эпителиальной клетке наряду с участием поверхностных рецепторов тимоцитов, в особенности CD4 и CD8, а также CD1, CD2, CD28, CD25, CD45 и их лшандов, а также различных молекул адгезии и их рецепторов, ведя в конечном итоге к позитивной или негативной селекции тимоцитов.

Нами была показана способность эпителиальной клеточной линии HTSC индуцировать апопгоз незрелых, дифференцирующихся тимоцитов, вызывать апоптоз активированных зрелых периферических Т-клеток и апоптоз трансформированных лимфоцитов больных Т-ОЛЛ и перевиваемых клеточных линий.

Нам представляется, что способность клеток линии HTSC вызывать апоптоз незрелых, зрелых и трансформированных Т-лимфоцитов предположительно основана прежде всего на контактном взаимодействии рецепторов Т-лимфоцитов с соответствующими МНС-комплексами на поверхности HTSC. Способность анти-CDS или анти-MHC-I МоАт избирательно блокировать апоптоз в данной системе подтверждает важность взаимодействия этой пары молекул в последующей индукции программированной клеточной гибели данными эпителиальными клетками. Наблюдаемая при этом селективность

может говорить в полыу рестрикции по шавному комплексу гисгосовместимосги определенного класса, «по возможно, имеет важное значение в процессах селекции тимоцитов in vivo. Так как взаимодействующие пары молекул в данной системе in vitro заведомо не соответствуют друг другу (вследствии различных источников этих клеток), мы предполагаем возможную роль этого несоответствия в последующей индукции апоптоза Т-лимфоцитов. Способность анти-1САМ-1 МоАт блокировать апоптоз тимоцитов говорит о важной роли молекул адгезии в опосредовании этого процесса. Представляется, что селекция тимоцитов in vivo является сложным комплексным процессом, в реализации которого задействовано большое количество поверхностных рецепторов как на поверхности лимфоцитов, так и на поверхности эпителиальных клеток. Соответствующее взаимодействие и взаимовлияние этих рецепторов наряду с различными гуморальными факторами, имеющими место in vivo, в конечном итоге определяет зрелый Т-клеточный репертуар.

ВЫВОДЫ:

1. Показана способность эпителиальных клеток тимуса линии HTSC индуцировать апоптоз тимоцитов; наиболее подверженными к HTSC-индуцированному апоптозу оказались незрелые формы Т-лимфоцитов (ДН и ДП), наиболее устойчивыми - зрелые CD4+CD8- и CD4-CD8+ тимоциты.

2. Клетки линии HTSC индуцируют апоптоз предварительно активированных Т-лимфоцитов доноров, а также Т-лимфоцитов больных T-OJIJI и перевиваемых клеточных линий; покоящиеся зрелые лимфоциты периферической крови усюйчивы к действию HTSC.

3. Обнаружена экспрессия Fas-рецептора на поверхности тимоцитов различных фракций и активированных Т-лимфоцитов, подвергающихся апоптозу, и способность внти-Fas МоАт ингибировать HTSC-индуцированный апоптоз.

4. Способностью индуцировать апоптоз тимоцитов и активированных Т-клеток обладают фиксированные клетки линии HTSC, а также надосадки клеток HTSC, активированных тнмоцнтами.

5. Показана способность моноклональных антител к МНС-I, CD8 и ICAM-1 блокировать апоптоз тимоцитов в исследуемой системе, что свидетельствует о вероятной роли пар молекул CD8/MHC-1 и LFA-I/ICAM-I в индукции апоптоза тимоцитов эпителиальными клетками.

6. HTSC-индуцированный апоптоз требует активной транскрипции и синтеза белков de novo, что доказано способностью ингибиторов синтеза ДНК, РНК и белка блокировать данный процесс.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.Г.Буланова, В.М.Будагян Тирозиновые протеинкиназы: роль в процессе активации лимфоцитов. //Мол. биология. - 1993. - Т. 27. - Вып. 4. - С. 725-733.

2. Е.Г.Буланова, В.М.Будагян Протеинфосфатазы: структура и функции. //Мол. биология. - 1994. - Т. 28. - С. 991-1001.

3. E.G.Bulanova, V.M.Budagyan, N.A.Romanova, L.Yu.Brovko, N.N.Ugarova Bioluminescent assay for human lymphocyte blast transformation. //Immunol. Lett. -1995.-Vol. 46.-P. 153-155.

Участок множительной техники ОНЦРАМН _

Заказ<?3? Тира- ТОО чкЭ