Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала

ДИССЕРТАЦИЯ
Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала - диссертация, тема по фармакологии
АВТОРЕФЕРАТ
Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала - тема автореферата по фармакологии
Агаджанян, Владимир Сергеевич Пятигорск 2009 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала

ии¿4гОЭ58

На правах рукописи

АГАДЖАНЯН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

гт атчдггшг'Т/" олло

1 IV! ци VI ¿ииУ

003470958

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

Защита состоится «30» июня 2009 года в 900 часов

на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. по защитам диссертаций при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан «15» мая 2009 г Ученый секретарь

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович

Компанцев Владислав Алексеевич доктор химических наук, профессор Озеров Александр Александрович

высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

д.ф.н., профессор

диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одной из важных задач современной фармацевтической химии является целенаправленный поиск соединений с заданными фармакологическими свойствами. С этой целыо используют различные подходы, одним из которых является изучение закономерностей взаимосвязи структура - активность. При таком поиске обязателен учет данных биохимической фармакологии, указывающих на причинно-следственные связи между возникновением патохнмических процессов и нарушением функционирования клеточной мембраны. Состояние последней, как известно, существенно зависит от уровня и скорости генерации активных форм кислорода (ЛФК) в организме. Вышедшая из-под лимитирующего контроля антиоксидантной системы организма чрезмерная генерация АФК является причиной оксидантного стресса клеток (увеличение перекисного окисления липидов) и, как следствие, приводит к формированию патологий.

Исходной активной формой кислорода в животном организме является супероксидный анион-радикал 02, на формирование которого в физиологической норме расходуется примерно 2% всего потребляемого кислорода. Большинство же остальных АФК (ОН*, N0% 02\ СЮ" и др.) в той или иной мере являются продуктами его биотрансформации.

Анализ данных литературы, посвященных антиоксидантам и изучению проявляемой ими активности свидетельствует о том, что их номенклатура ограничена преимущественно препаратами, относящимися к двум группам -донорам протонов (токоферол, пробукол, кислота аскорбиновая) и полиенам (ретинол, каротиноиды). Они не лишены недостатков, так как слабо защищают белки и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения.

Эндогенные антиоксиданты являются важнейшим звеном защитной системы организма, поэтому исследования по целенаправленному поиску индивидуальных веществ и/или суммарных композиций, проявляющих как антирадикальную активность, так и способных предохранять элементы собственной антиоксидантной системы, имеют важное значение.

В настоящее время существует четкая классификация известных антиоксидантов, основанная на структурных признаках молекул, ответственных за проявление антиоксидантных свойств. Учитывая это, можно проводить поиск новых антиоксидантов как путем целенаправленного синтеза, так и созданием оптимальных композиций антиоксидантов на основе природных соединений растительног о происхождения.

Одним из таких перспективных и легкодоступных источников суммарных композиций антиоксидантов может служить мякоть плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.). В литературе до сих пор отсутствуют сведения о наличии в её составе фенольных соединений, однако применение в народной медицине в качестве гепатопротекторного, желчегонного, противовоспалительного средства свидетельствует о наличии данной группы соединений и является достаточным обоснованием для проведения химических и биохимических исследований.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является химическое и биологическое изучение ангиоксидантной активности сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной, а также выявление взаимосвязи структура-активность 16 индивидуальных производных коричной кислоты, пять из которых являются компонентами данного сухого экстракта.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

S с помощью предварительного биохимического скрининга, обосновать выбор растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей ангиоксидантной активностью;

■S провести химический анализ сухого экстракта и количественно

охарактеризовать в нем основные группы БАВ; S разработать методику количественного определения группы соединений, вносящих существенный вклад в проявляемую сухим экстрактом антиоксидантную активность;

полуэмпирическими квантово-химическими методами изучить основные индексы реакционной способности производных коричной кислоты в отношении АФК на примере (*ОН) и на их основе обосновать структуру, характеризующуюся более высокой антиоксидантной активностью.

Научная новизна. На основе предварительного биохимического скрининга сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью, а также СОД-протекторной активностью обладает сухой экстракт, полученный после обработки сырья спиртом этиловым 70%. Использование данного экстрагента обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов в целевом продукте - 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

Впервые методом ВЭЖХ в мякоти тыквы обыкновенной определены галловая, изоферулозая, кофейная, цикоревая и коричная кислоты, а также кверцетин, апигенин, суммарное содержание которых в полученном сухом экстракте составляет 12,8%.

Предложена методика спектрофотометрического определения количественного содержания суммы производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте (найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту). По данным химического анализа в нём определены следующие групп БАВ: аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС -3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлеменш - 48,78% (в золе); аскорбиновая кислота - 3,98±0,13%; каротиноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

Экспериментально (in vivo) изучены иммунотропная и СОД-протекторная активности сухого экстракта мякоти тыквы. Установлено дозо-зависимое увеличение lgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кгв 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг - 1,85 раза относительно контроля), уменьшение воспалительного эффеета при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю). Выявлен дозо-зависимый эффект подавления воспалительных реакций,

вызванных подкожным введением гистамина и декстрана (в дозе 500 мг/кг на 40,3% и 48,2% соответственно). В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu-, Zn- супероксиддисмутазе.

Полуэмпирическими квантово-химическими методами (РМЗ и AMI) изучены индексы реакционной способности в ряду гидрокси- и метоксипроизводных коричной в отношении активных форм кислорода. По значениям величин порядков связей, связевых чисел и валентностей соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах предложен новый показатель - суммарный индекс ненасыщенности (IUA). Он объективнее отражает способность структуры выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов.

В эксперименте in vitro установлено, что антиоксидантная активность индивидуальных производных коричной кислоты достоверно, в среднем на 40%, превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. По результатам квантово-химических расчетов обоснована структура 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, для которой экспериментально выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (С1/29,8±0,4 мкМ), который превышает аналогичный показатель для кофейной (С|/2=15,7±0,4 мкМ), синаповой (С1/2=17,0±0,ЗмкМ) и 3,4,5-тригидрокси-коричной (Ci/2=12,0±0,6mkM) кислот, а также дибунола (С, /2=21,2±0,8мкМ).

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,911. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

Практическая значимость работы.

Предложен и обоснован способ получения сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной. Разработана методика спектрофотометрического определения в нём суммы производных коричной кислоты.

Обоснована и экспериментально подтверждена антиоксидантная активность 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, превосходящая таковую дибунола в 1,5 раза.

Исходя из количественного содержания суммы антиоксидантов, а также экспериментально установленной СОД-протекторной и имуннотропной активности, сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной в перспективе может быть рекомендован для последующего исследования.

Внедрение результатов в практику.

Материалы по изучению тыквы обыкновенной и сухого экстракта, полученного из неё, переданы в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований. Для дальнейшего более глубокого фармакологического изучения антиоксидантной активности предлагаемый сухой экстракт мякоти тыквы обыкновенной передан в лабораторию микросомального окисления ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. По материалам исследования составлено учебно-методическое пособие «Активные формы кислорода и природные антиоксиданты», используемого в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА.

Положения, выдвигаемые на защиту: ^ обоснование выбора растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей СОД-протекторной и антиоксидантной активностью;

результаты исследования качественного и количественного состава сухого экстракта мякоти тыквы;

методика количественного определения суммы гидроксипроизводных коричной кислоты в целевом продукте;

^ квантово-химическое обоснование антиоксидантной активности

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты; ^ корреляционные зависимости между суммарной ненасыщенностью циннамоильного фрагмента в структуре производных коричной кислоты и проявляемой антиоксидантной активностью.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работ ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01.200101060.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы изложены на:

> четвертом международном симпозиуме "Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие интернет-ресурсы СМТР1-2007" (Москва, сентябрь 2007 года);

> конгрессе "Человек и лекарство" Краснодар -2008г.;

> 63-й и 64-й научной конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009г.).

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе учебно-методическое пособие, используемое в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 160 источников, в том числе 65 иностранных; содержит 30 таблиц, 20 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обоснование выбора экстрагента

Суммарные композиции антиоксидантов из мякоти плодов тыквы обыкновенной нами были получены в виде сухих экстрактов с использованием в качестве растворителей воды и спирта этилового 40%, 70% и 95% концентрации.

Биохимический скрининг антиоксидантной активности извлечений показал, что сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной, полученный с использованием спирта этилового 70%, обладает как наибольшей антирадикальной (ингибирование реакции генерации супероксидного анион-радикала на 37,97±1,09уо), так и СОД-прогекторной активностью (сохранение активности фермента на уровне 64,8±1,3%) в сравнении с другими фракциями.

Одновременно с этим изучена суммарная концентрация антиоксидантов в сухих экстрактах. Определения в пересчете на галловую кислоту и/или кверцетин осуществляли на жидкостном хроматографе Цвет Яуза-01 -АА с амперометрическим детектором.

Результаты исследования показали, что максимальная концентрация антиоксидантов содержится в сухом экстракте, полученном с использованием спирта этилового 70%, что хорошо согласуется с данными биохимического скрининга.

Для интерпретации полученных данных как по суммарному содержанию антиоксидантов, так и по проявляемой ими активности, мы сочли целесообразным изучить химический состав данного сухого экстракта из мякоти плодов тыквы обыкновенной (далее по тексту сухой экстракт), что представлено в таблице 1.

Количественное определение антиоксидантов

Суммарную концентрацию антиоксидантов в сухом экстракте определяли жидкое гном хроматографе Цвет Яуза 01-АА. Содержание антиоксидантов составляет 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин,

который рекомендован в качестве стандарта для данного прибора ВНИИ Метрологической службы.

Таблица 1 - Содержание биологически активных веществ в сухом экстракте мякоти тыквы обыкновенной

Макро- и микроэлементы Аминокислотный состав Полисахаридный состав Витаминный состав

48,78% (в золе); Свободные -1,17%; Связанные -0.) %. Преобладающие: Гистидин - 0,26 %; Аспапогиновая кислота - 0,23 %; Тирозин — 0,13%; Фенилаланин - 0,1%. Водорастворимые полисахариды 3,36 % (глюкоза, ксилоза) Пектиновые вещества 13,43% (глюкоза, рамноза) Гемицеллюлоза А 9,89 % (галактоза) Гемицеллюлоза Б 5,44% (глюкоза, рамноза) Аскорбиновая кислота 3,98% Каротиноиды 0,0014%

Определение полифенольпых соединений

Для качественной и количественной характеристики полифенольных соединений нами использован метод ВЭЖХ.

Данным методом в сухом экстракте мякоти тыквы обыкновенной идентифицированы 7 соединений полифенольной природы, среди которых количественно преобладают производные коричной кислоты: изоферуловая -31,25%, цикоревая - 18,22%, коричная - 6,88%, кофейная кислоты - 1,94%, а также галловая кислота - 33,93%, кверцетин - 7,77% и апигенин - 0,0001%. Выраженная антиоксидантная активность исследуемого сухого экстракта обусловлена, в том числе, содержанием перечисленных полифенолов.

Для производных коричной кислоты имеются многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об антиоксидантной, радиопротекторной, церебропротекторной и нейропротекторной активности. Более того, остаток коричной кислоты в виде циннамоильного фрагмента входит в структуру флавоноидов.

Количественное определение содержания производных коричной кислоты

Для определения количественного содержания производных коричной кислоты использован спектрофотометрический метод. С этой целью нами предварительно была изучена зависимость оптической плотности продукта (>.=355нм), образующегося при взаимодействии кофейной кислоты с алюминия хлоридом, от её концентрации (рисунок 1).

Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности раствора (А355нм) от концентрации кофейной кислоты

Установлено, что в пределах концентраций 1-10 мг/л график имеет линейный характер и описывается уравнением у=0,081х+0,009. Коэффициент корреляции при этом равен 0,992, что позволяет использовать предложенную методику для количественного определения содержания гидроксипроизводных коричной кислоты.

При анализе содержания гидроксипроизводных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте следует учитывать поглощение компонентов, не относящихся к производным анализируемого группы соединений.

0,9

1

2

3456789 10

Концентрация кофейной кислоты (Смг/л)

Для устранения влияния такого «фона», а также с целью получения очищенной суммы производных коричной кислоты, сухой экстракт исчерпывающе обрабатывали сухим этилацетатом, фильтровали и фильтрат сушили над безводным сульфатом натрия, после чего полностью удаляли растворитель (на кипящей водяной бане). С полученной суммой полифенолов далее проводили спектральные исследования. На рисунке 2 представлены спектры поглощения растворов стандартного образца кофейной кислоты (а), очищенной суммы полифенольных соединений из сухого экстракта (б), а также продуктов их взаимодействия с алюминия хлоридом (в, г - соответственно).

0.7

0,6

<

0,5

и

1 0,4

о

g 0,3

3 ¡л

о 0,2

Е

и

в

0.1

о

250 275 300 325 350 375 400 425 450

Длина волны Я. ны

Рисунок 2 - Спектры поглощения растворов кофейной кислоты и очищенного комплекса полифенолов из сухого экстракта

Аналогично определяли гидроксипроизводные коричной кислоты, содержание которых в сухом экстракте составляет 8,24±0,11%. Использованная нами методика валидирована согласно рекомендациям ICH по таким показателям, как линейность (у=0,081 х+0,009, R2=0,992), прецизионность (RSD=0,929%), точность (RSD=3,09%).

Интерпретация антиоксидшттой активности кваитово-химическими методами

Выявленная в эксперименте in vitro высокая антиоксидантная и СОД-протекторная активность сухого экстракта, а также количественное содержание в нем производных коричной кислоты явились основанием для проведения последующих исследований с применением методов квантовой механики.

Структурные особенности, а именно, наличие сопряженной системы, включающей ароматическое ядро, виниленовую и карбоксильную группы, создают предпосылки для проявления высокой реакционной способности коричной кислоты в отношении АФК.

Используя полуэмпирические квантово-химическими методы анализа, нами были изучены индексы реакционной способности в ряду гидроксипроизводных коричной кислоты (таблица 2) в возможных радикальных реакциях с активными формами кислорода.

Такой подход с использованием репрезентативного ряда соединений позволяет не только выявить закономерности взаимосвязи структура-антиоксидантная активность, но и избежать неточностей и ошибок в интерпретации полученных результатов.

Таблица 2 - Гидрокси- и метоксипроизводные коричной кислоты

«з

9. R,=R2=R3=R4=H; 1. R2=OH; R3=OCH3; R,=R4=H

10. R,=OCH3; R2=R3=R4=H; 2. R2=OCH3; R3=OCH3; R,=R,=H;

11. R2=OH; Ri=R3=R4=H; 3. R2=R3=R4=OH; R,=H;

12. R2=OCH3; R,=R3=R4=H; 4. R2=OCH3; R3=R4=OH; R,=OH;

13. R3=OH; R,=R2=R4=H; 5. R2=R,=OH; R3=OCH3; R,=H;

14. R3=OCH3; R,=R2=R4=H; 6. R2= R3=OCH3; R4=OH; RI=H;

15. R2=R3=OH; R,=R,=H; 7. R2= R4=OCH3; R3=OH; RI=H;

16. R2=OCH3; R3=OH; RI=R4=H; 8. R2= R3= R,=OCH3; ReH;

Здесь и далее по тексту в анализируемых структурах приводится нумерация атомов, в соответствии с расчетными программами (\Vinmopac 7.21). Сопоставление результатов квантово-химических расчетов позволило

выявить взаимосвязи между структурой и анитрадикальной активностью, а также предложить возможные механизмы взаимодействия с активными формами кислорода. Для выявления наиболее вероятных центров первичной атаки радикала мы использовали величины порядков связей (Р1П,) и связевых чисел (Ым) атомов углерода. Известно, что в реакциях свободнорадикального присоединения более предпочтительным является участие атомов с наименьшими значениями связевых чисел, характеризующих степень «насыщенности» данного атома. Из этого следует, что первичная атака молекул анализируемых структур наиболее вероятна по положениям 1,2,3,5 и 8. Необходимо подчеркнуть, что положение 8 характеризуется наименьшей степенью «насыщенности» (по сравнению с ближайшими атомами), в связи с чем именно по С-8 первичная атака более предпочтительна.

Поскольку АФК характеризуются сравнительно высокими электрофильными свойствами, то для подтверждения направления атаки мы сочли целесообразным рассчитать распределение Малликеновских зарядов и электронной плотности на атомах углерода. Установлено, что наибольшая электронная плотность в анализируемых производных сосредоточена именно в положении С-8.

Дальнейшее последовательное образование аддуктов возможно по положениям С-7, С-6, С-1, С-5. Для подтверждения такого вывода нами осуществлен расчет энтальпий образования промежуточных интермедиатов. Полученные таким путем данные указывают на то, что наиболее устойчивые аддукты образуются при гидроксилировании по С-8 атому.

По такому же алгоритму на следующем этапе нами были рассчитаны порядки связей (Р^) и связевые числа (Ый) для атомов углерода в интермедиате, образующемся на 1-ой стадии гидроксилирования (по С-8). Вторая стадия гидроксилирования будет предпочтительно осуществляться по положению С-7 с образованием диола.

Анализ этих же величин в образовавшемся диоле указывает на то, что следующий этап гидроксилирования должен был бы реализоваться по С-9,

т.е. по углероду карбоксильной группы, что по понятным причинам исключено. Такое несоответствие, по-видимому, объясняется тем, что при толковании реакционной способности атома, не учитывается величина его теоретической валентности.

Поэтому, исходя из значений величин порядков связей, связевых чисел и теоретической валентности соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах, нами предлагается учитывать - индекс «ненасыщенности» атача (IUA index unsaturation atom), который численно равен разнице между теоретической валентностью и связевым числом для каждого атома. Чем больше величина индекса ненасыщености атома, тем выше вероятность образования новых связей этим атомом.

Предполагаемые механизмы взаимодействия коричной кислоты с гидроксильным радикалом показаны ниже:

"с он

■ОН

(ГГ

■ он

I

он

•ОН

^V^H с он

поС-8 -1 поС-7

• он

I

• он

не он

поС-6

поС-1

поС-5

Из данных таблицы 3 следует, что наибольшая степень ненасыщенности у С-6 и последующая атака радикала, вероятнее всего, будет проходить именно по этому положению в диоле. Положение С-9 здесь характеризуется наименьшим индексом ненасыщенности.

Аналогично для всех 16-ти исследуемых производных коричной кислоты найдены индексы ненасыщенности ГУА.

Таблица Э - Величины связевых чисел (1ЧД теоретической валентности (V,,) и индекса ненасыщености (ША) атомов углерода в молекуле промежуточного диола

он

I 9 ✓

?8

он

положение Су атома

1 .2 8 7 ..:. 9

3,957 3,959 3,957 3,958 3,959 3,959 3,926 3,929 3,820

М„ 3,777 3,793 3,797 3,810 3,816 3,816 3,793 3,847 3,771

И/А 0.180 0,166 0,160 0,148 0,143 0,143 0,133 0,082 0,049

- сортировка атомов (слева направо) проведена по убыванию значений (ША)___

Сопоставляя между собой динамику распределения электронной плотности и индекса ненасыщенности в ароматическом фрагменте, можно констатировать, что в незамещенной коричной кислоте повышенная электронная плотность отмечается в положениях С-3, С-4 и С-5, а наибольшие значения индекса ненасыщенности - для С-1, С-2 и С-6. Совпадение ориентации обоих индексов на одних и тех же атомах углерода наблюдается в монозамещенных производных, в которых электронодонор ный заместитель находится в положении С-2 (соединения 3, 4), а также для структур с трет заместителями (соединения 13 и 14).

В ароматическом фрагменте изоферуловой кислоты (соединение 9) имеются два атома углерода (С-1, С-5), которые характеризуются наибольшими значениями как электронной плотности, так и индекса «ненасыщенности», а у изомерной феруловой кислоты имеется лишь один такой атом углерода (С-1).

Для гидроксипроизводных следует также учитывать участие фенольных гидроксигрупп в связывании активных форм кислорода, поскольку механизм антиоксидантной активности полифенольных соединений реализуется в том числе и за счет гемолитического расщепления связи О-Н. Оценка реакционной способности фенольных гидроксигрупп осуществлялась нами путем анализа величин порядков связи (Рои). Из полученных данных следует, что более предрасположенной к

гемолитическому расщеплению связи О-Н является гидроксигруппа у С-3 соединения 15 РО-ц=1,01.

Не менее важным дескриптором для анализа и прогнозирования антиоксидантной активности соединений является потенциал ионизации молекулы, который численно равен разности между энергией высшей занятой молекулярной орбитали (Е,тю, относительная электронодонорная способность молекулы) и энергией низшей свободной молекулярной орбитали (Енсмо, относительная электроноакцепторная способность). Найденная таким способом разность Евзмо ^!:с\'о равна первому потенциалу ионизации молекулы. Чем больше эта величина, тем легче переход молекулы в возбужденное состояние и тем выше её реакционная способность. Найденные таким путем значения потенциала ионизации для исследуемых соединений показывают, что соединения 7 (кофейная кислота), 15 (3,5-диметокси-4-гидроксикоричная кислота) и 9 (изоферуловая кислота) характеризуются наименьшими значениями данного дескриптора, что подтверждает их более высокую реакционную способность при взаимодействии с АФК.

Обоснование антиоксидантной активности 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты

Значительный интерес среди фенольных антиоксидантов представляют пространственно-затрудненные фенолы, например дибунол (ионол), представляющий собой 2, 6 — ди-трет-бутил-4-метилфенол. Принцип молекулярного конструирования подобных соединений основан на использовании «ара-замещенных 2,6-ди-трет-• бутилфенолов с различными функциональными ; группами.

Основываясь на полученных нами , экспериментальных данных и расчетах мы обосновали структуру, которую можно получить путем замены метальной группы в положении 4 дибунола на остаток

Лабораторное название ДИТРЕТОКСИКОР

пропеновой кислоты, что приводит к формированию соответствующего производного, а именно, 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты. Оно было синтезировано и описано другими авторами в 2008 году при изучении реакции анионной конденсации бензальдегидов. Однако, сведения об антиоксидантной активности данного соединения отсутствуют.

В этой связи по приведенным выше методикам нами осуществлен квантово-химический анализ предлагаемой структуры. Это позволило установить следующие особенности:

S 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричная кислота обладает наибольшей суммарной степенью ненасыщенности атомов углерода циннамоильного фрагмента и характеризуется наименьшим значением величины первого потенциала ионизации; S связь О-Н в предлагаемой структуре характеризуется наименьшим значением порядка связи, поэтому легче подвергается гомолитическому разрыву, а образующийся при этом феноксильный радикал имеет более низкую энтальпию образования, чем аналогичный радикал, образуемый из дибунола (для дибунола ДН=-130,55 кДж/моль, для дитретоксикора ДН=-140,64 кДж/моль).

Изучение биологической активности

Исследование СОД-протекторной активности сухого экстракта мякоти тыквы in vivo проводили на кафедре биологии, физиологии и патологии ПятГФА совместно с к.ф.н Дьяковой И.Н., а иммунотропные эффекты данного экстракта изучали на кафедре клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики ФППВ КГМУ под руководством д.м.н., профессора Ханферяна Р.А, за что мы выражаем им свою искреннюю благодарность и признательность.

Установлено что пероральное введение лабораторным животным (мышам) в течение 14 дней сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной достоверно способствует дозо-зависимому эффекту увеличения IgM-антителогенеза (увеличение количества IgM-антителобразующих клеток

на миллион клеток в селезенке в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшению величины отека ланки мыши при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

Десятидневное пероральное введение крысам изучаемого сухого экстракта дозо-зависимо подавляет воспалительные эффекты, вызванные подкожным введением гистамипа и декстрана на 40,3% и 48,2% соответственно.

При внутрибрюшинном введении лабораторным мышам метмлглиоксаля в концентрации 55мМ и сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной (в дозе 100мг на 1кг массы животного) активность эритроцитарной супероксиддисмутазы сохраняется на исходным уровне 71,7±2,3%, тогда как активность модифицированного метилглиоксалем фермента составляет всего 22,2±0,9%.

Антиоксидантную активность индивидуальных соединений in vitro определяли по степени ингибирования генерации супероксидного анион-радикала, инициированного аутоокислением адреналина. В эксперименте определяли так называемую концентрацию половинного ингибирования (Cm), т.е. концентрацию, вызывающую ингибирование реакции генерации супероксидного анион-радикала на 50%; при этом, чем меньше значение С1/2, тем выше активность изучаемого соединения.

В таблице 4 приведены результаты данного исследования, го которых следует, что уровень выявленной в эксперименте антиоксидантной активности производных коричной кислоты на три порядка превышает таковой для бензойной и салициловой кислот. Более того, антиоксидантная активность исследуемых производных коричной кислоты достоверна: в среднем на 40% превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. Для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутил-коричной кислоты (дитретоксикора) (соединение 17), выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (С1/2=9,8±0,4 мкМ), который превышал

аналогичный показатель для кофейной (С1/2—15,7±0,4 мкМ), синаповой (С1/2=17,0±0,ЗмкМ) и 3,4,5-тригидроксикоричной (С1/г=12,0±0,6мкМ) кислот, а также дибунола (Ст=21,2±0,8мкМ).

Таблица 4 - Антиоксидантная активность индивидуальных соединений

Название Концентрация половинного ингибирования,реакции генерации супероксидного анион-радикала, Сщ (мкМ) Показатель суммарной ненасыщенности

Бензойная кислота (8,4±0,2) -103 -

Салициловая кислота (3,6*0,1) КГ -

Галловая кислота 55,4±0,5 -

Дибунол 21,2±0,8 -

Аскорбиновая кислота 27,5±0,4 -

Рутин 49,9±0,4 -

Квсрцстин 60,3±0,3 -

Дигидрокверцетин 45,5±0,5 -

Коричная кислота 32,4±0,3 1,612

о-метокси-коричная кислота 26,4±0,4 1,795

л-гидрокси-коричная кислота 30,3±0,5 1,734

3,4-дигидрокси-коричная кислота 15,7±0,4 2,029

З-метокси-4-гидрокси-коричная кислота 23,7±0,6 1,961

3 -гидрокси-4-метокси-коричная кислота 22,2±0,4 2,041

3,4,5-тригидрокси-коричиая кислота 12,0±0,6 2,227

3,5-диметокси-4-гидрокси-коричная кислота 17,0±0,3 2,177

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутил-коричиая кислоты 9,8±0,4 2,236

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,9П. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Предварительный биохимический скрининг сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, показал, что наибольшей антиоксидантной и СОД-протекторной активностью обладает целевой продукт, полученный с использованием спирта этилового 70%. Данный экстрагент обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов -174,9+2,4 мг/г(17,5%) в пересчете на кверцетин.

2. Осуществлен химический анализ сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, полученного экстракцией спиртом этиловым 70%, и в нем количественно охарактеризованы аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС - 3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементны - 48,78% (в пересчете на золу); аскорбиновая кислота - 3,98±0,13%; кароткноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

3. Изучен полифенолышй состав полученного сухого экстракта к установлено, что преобладающими в нем соединениями являются изоферуловая, кофейная, цикоревая, коричная, галловая кислоты, а также апигенин и кверцетин, содержание которых в сумме составляет 128,23 мг/г (12,82%).

4. Предложена методика количественного определения суммарного содержания производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте, найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту.

5. Использование дескрипторов, рассчитанных полуэмпирическими квантово-химическими методами РМЗ и AMI, позволило выявить наиболее реакционноспособные центры в циннамоильном фрагменте. Установлено, что взаимодействие коричной кислоты с гидроксильным радикалом в первую очередь происходит по виниленовому фрагменту (С7-С8) и далее в следующей последовательности С6, CI, С5.

6. Прогноз акткоксидантной активности для индивидуальных гидрокси- и метоксипроизводных коричной кислоты позволил обосновать

наибольшую активность для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, что далее было подтверждено экспериментально её синтезом и анализом биологического действия.

7. Установлены иммунотропный эффект сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, а именно увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг - 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

8. В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого зкстршста мякоти тыквы обыкновенной по отношению к зритроцитарнои Cu, Zn - супероксиддисмутазе.

9. Сопоставление экспериментально найденных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с показателем суммарной ненасыщенности молекул, рассчитанным квантово-химическим методом, позволило выявить линейную зависимость между этими параметрами с коэффициентом корреляции 0,911.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Активные формы кислорода и природные антиоксиданты: учебно-методическое пособие для интернов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - 48с. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.).

2. Применение квантово-химических методов анализа для интерпретации антирадикальной активности в ряду гидроксипроизводых коричной кислоты // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - Т.42, № II-С. 12-17. (Соавт. Оганесян Э.Т.).

3. Применение квантово-химических методов анализа для поиска новых антиоксидантов в ряду производных коричной кислоты // Человек и лекарство; тез. докл. 16 Рос. нац. конгр. 6-10 апр. 2009 г. — М., 2009. — С. 251. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.)

22

4. Природные антиоксиданты и современные подходы к изучению антиоксидантного действия. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. -Деп. в ВИНИТИ РАН 31.01.06, № 110-В-06. - 39 с.

5. Реактивация эритроцитарной супероксиддисмутазы под влиянием фармакологически активной фракции из мякоти тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64. - С. 376-378. (Соавт. Оганесян Э.Т., Дьякова И.Н.).

6. Фенольный состав фармакологически активной фракции, полученной из тыквы обыкновенной (Cucurbita реро L.) // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2009. - Вып.64. - С.6-7.

7. Целенаправленный поиск веществ с заданными фармакологическими свойствами // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - №2. -С. 37-40. (Соавт. Оганесян Э.Т., Кодониди И.П., Смирнова Л.П., Муцуева С.Х., Кодониди М.И., Золотых Д.С.)

8. Экспериментальное изучение антиоксидантной активности в ряду различных производных коричных кислот // Человек и лекарство: тез. докл. 16-18 апр. 2008 г. - Краснодар, 2008. - С. 3. (Соавт. Оганесян Э.Т., Муцуева С.Х.).

9. Application of the quantum-chemical analytical methods to substantiate the antiradical activity in the flavone, chalcone and cinnamic acid hydroxyderivative series // Fourth international symposium on computational methods in toxicology and pharmacology integrating internet resources (CMTPI 2007), Moscow, Russia, September 1-5, 2007. - P.72. (Oganesyan E.).

АГАДЖАНЯН ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикалыюй активностью в отношении супероксидного анион-радикала

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации не соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 643

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

 
 

Оглавление диссертации Агаджанян, Владимир Сергеевич :: 2009 :: Пятигорск

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПРИРОДНЫЕ АНТИОКСИДАНТЫ И СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МЕХАНИЗМОВ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. РАЗНООБРАЗИЕ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ.

1.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИХ РАСЧЕТОВ ДЛЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ.

1.3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ.

1.4. ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ.

ГЛАВА 2. ПОЛУЧЕНИЕ И ХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ФРАКЦИИ ИЗ МЯКОТИ ТЫКВЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (CUCURBITA PEPO L.).

2.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1.1. Обоснование выбора экстрагента.

2.1.2. Изучение элементного состава.

2.1.3. Аминокислотный состав.

2.1.4. Полисахаридный состав.

2.1.5. Количественное определение антиоксидантов.

2.1.5.1. Определение полифенольных соединений.

2.1.5.2. Количественное определение аскорбиновой кислоты.

2.1.5.3. Количественное определение производных Р-каротина.

2.1.6. Количественное определение производных коричной кислоты.

2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.2.1. Получение суммарных фракций из мякоти тыквы обыкновенной

2.2.2. Определение антиоксидантной активности.

2.2.3. Определение СОД-протекторной активности.

2.2.4. Определение суммарной концентраций антиоксидантов на жидкостном хроматографе Цвет Яуза 01-АА.

2.2.5. Определение БАВ в исследуемом сухом экстракте.

2.2.5.1. Макро- и микроэлементный состав.

2.2.5.2. Аминокислотный состав.

2.2.5.3. Полисахаридный состав.

2.2.5.4. Полифенольный состав.

2.2.5.5. Производные Р-каротина.

2.2.6. Количественное определение производных коричной кислоты.

2.3. ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ.

ГЛАВА 3. ПРИМЕНЕНИЕ КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ДЛЯ ИНТЕРПРЕТАЦИИ И ПРОГНОЗА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ В РЯДУ ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ КОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ.

3.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1.1. Интерпретация антиоксидантной активности.

3.1.2. Обоснование 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты

3.1.3. Прогноз уровня антиоксидантной активности с помощью программы PASS.

3.1.4. Прогноз метаболизма предлагаемой структуры.

3.1.5. Синтез 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутшкоричной кислоты.

3.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.3. ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ.

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ.

4.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1.1. Иммунотропный эффект сухого экстракта мякоти тыквы.

4.1.2. Реактивация эритроцитарной супероксиддисмутазы под влиянием сухого экстракта мякоти тыквы.

4.1.3. Оценка антиоксидантной активности (in vitro) 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты (дитретоксикора) . 108 4.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.2.1. Генерация супероксидного аион-радикала в реакции аутоокисления адреналина.

4.2.2. Определение СОД-протекторной активности (in vivo).

4.2. ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Агаджанян, Владимир Сергеевич, автореферат

Актуальность проблемы. Одной из важных задач современной фармацевтической химии является целенаправленный поиск соединений с заданными фармакологическими свойствами. С этой целью используют различные подходы, одним из которых является изучение закономерностей взаимосвязи структура - активность. При таком поиске обязателен учет данных биохимической фармакологии, указывающих на причинно-следственные связи между возникновением патохимических процессов и нарушением функционирования клеточной мембраны. Состояние последней, как известно, существенно зависит от уровня и скорости генерации активных форм кислорода (АФК)* в организме. Вышедшая из-под лимитирующего контроля антиоксидантной системы организма чрезмерная генерация АФК является причиной оксидантного стресса клеток (увеличение перекисного окисления липидов) и, как следствие, приводит к формированию патологий.

Исходной активной формой кислорода в животном организме является супероксидный анион-радикал 02 , на формирование которого в физиологической норме расходуется примерно 2% всего потребляемого кислорода. Большинство же остальных АФК (ОН*, N0*, 02\ С1СГ и др.) в той или иной мере являются продуктами его биотрансформации.

Анализ данных литературы, посвященных антиоксидантам и изучению проявляемой ими активности свидетельствует о том, что их номенклатура ограничена преимущественно препаратами, относящимися к двум группам -донорам протонов (токоферол, пробукол, кислота аскорбиновая) и полиенам (ретинол, каротиноиды). Они не лишены недостатков, так как слабо защищают белки и нуклеиновые кислоты от окислительного повреждения.

Эндогенные антиоксиданты являются важнейшим звеном защитной системы организма, поэтому исследования по целенаправленному поиску индивидуальных веществ и/или суммарных композиций, проявляющих как антирадикальную активность, так и способных предохранять элементы собственной антиоксидантной системы, имеют важное значение.

В настоящее время существует четкая классификация известных антиоксидантов, основанная на структурных признаках молекул, ответственных за проявление антиоксидантных свойств. Учитывая это, можно проводить поиск новых антиоксидантов как путем целенаправленного синтеза, так и созданием оптимальных композиций антиоксидантов на основе природных соединений растительного происхождения.

Одним из таких перспективных и легкодоступных источников суммарных композиций антиоксидантов может служить мякоть плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo L.). В литературе до сих пор отсутствуют сведения о наличии в её составе фенольных соединений, однако применение в народной медицине в качестве гепатопротекторного, желчегонного, противовоспалительного средства свидетельствует о наличии данной группы соединений и является достаточным обоснованием для проведения химических и биохимических исследований.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований является химическое и биологическое изучение антиоксидантной активности сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной, а также выявление взаимосвязи структура-активность 16 индивидуальных производных коричной кислоты, пять из которых являются компонентами данного сухого экстракта.

Для достижения поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

S с помощью предварительного биохимического скрининга, обосновать выбор растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей антиоксидантной активностью;

S провести химический анализ сухого экстракта и количественно охарактеризовать в нем основные группы Б AB; S разработать методику количественного определения группы соединений, вносящих существенный вклад в проявляемую сухим экстрактом антиоксидантную активность;

S полуэмпирическими квантово-химическими методами изучить основные индексы реакционной способности производных коричной кислоты в отношении АФК на примере (ЮН) и на их основе обосновать структуру , характеризующуюся более высокой антиоксидантной активностью.

Научная новизна. На основе предварительного биохимического скрининга сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, установлено, что наибольшей антиоксидантной активностью, а также СОД-протекторной активностью обладает сухой экстракт, полученный после обработки сырья спиртом этиловым 70%. Использование данного экстрагента обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов в целевом продукте - 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

Впервые методом ВЭЖХ в мякоти тыквы обыкновенной определены галловая, изоферуловая, кофейная, цикоревая и коричная кислоты, а также кверцетин, апигенин, суммарное содержание которых в полученном сухом экстракте составляет 12,8%.

Предложена методика спектрофотометрического определения количественного содержания суммы производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте (найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту). По данным химического анализа в нём определены следующие групп БАВ: аминокислоты - 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС -3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементы — 48,78% (в золе); аскорбиновая кислота — 3,98±0,13%; каротиноиды - 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

Экспериментально (in vivo) изучены иммунотропная и

СОД-протекторная активности сухого экстракта мякоти тыквы. Установлено дозо-зависимое увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к, контролю). Выявлен дозо-зависимый эффект подавления воспалительных реакций, вызванных подкожным введением гистамина и декстрана (в дозе 500 мг/кг на 40,3% и 48,2% соответственно). В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu-, Zn- супероксиддисмутазе.

Полуэмпирическими квантово-химическими методами (РМЗ и AMI) изучены индексы реакционной способности в ряду гидрокси- и метоксипроизводных коричной в отношении активных форм кислорода. По значениям величин порядков связей, связевых чисел и валентностей соответствующих атомов углерода в анализируемых структурах предложен новый показатель - суммарный индекс ненасыщенности (IUA). Он объективнее отражает способность структуры выступать в качестве «ловушки» свободных радикалов.

В эксперименте in vitro установлено, что антиоксидантная активность индивидуальных производных коричной кислоты достоверно, в среднем на 40%, превышает активность рутина, кверцетина и дигидрокверцетина. По результатам квантово-химических расчетов обоснована структура 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, для которой экспериментально выявлен наибольший уровень антиоксидантной активности (Ci/2=9,8±0,4 мкМ), который превышает аналогичный показатель для кофейной (С1/2=15,7±0,4 мкМ), синаповой (Ci/2=17,0±0,3mkM) и 3,4,5-тригидрокси-коричной (С1/2=12,0±0,6мкМ) кислот, а также дибунола (С 1/2=21,2±0,8мкМ).

Сопоставление полученных экспериментальных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с рассчитанными на основе квантово-химического анализа показателями суммарной ненасыщенности молекулы, позволило выявить линейную зависимость между ними с коэффициентом корреляции 0,911. Такой подход может быть использован в исследованиях по целенаправленному поиску антиоксидантов в ряду других природных соединений.

Практическая значимость работы.

Предложен и обоснован способ получения сухого экстракта из мякоти тыквы обыкновенной. Для его стандартизации разработана методика спектрофотометрического определения гидроксипроизводных коричной кислоты.

Обоснована и экспериментально подтверждена антиоксидантная активность 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, превосходящая таковую дибунола в 1,5 раза.

Исходя из количественного содержания суммы антиоксидантов, а также экспериментально установленной СОД-протекторной и имуннотропной активности, сухой экстракт из мякоти тыквы обыкновенной в перспективе может быть рекомендован для последующего исследования.

Внедрение результатов в практику.

Материалы по изучению тыквы обыкновенной и сухого экстракта, полученного из неё, переданы в НИИ питания РАМН для дальнейших совместных исследований. Для дальнейшего более глубокого фармакологического изучения антиоксидантной активности предлагаемый сухой экстракт мякоти тыквы обыкновенной передан в лабораторию микросомального окисления ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН. По материалам исследования составлено учебно-методическое пособие «Активные формы кислорода и природные антиоксиданты», используемого в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА.

Положения, выдвигаемые на защиту: ^ обоснование выбора растворителя для получения сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, характеризующегося наибольшей СОД-протекторной и антиоксидантной активностью; ^ результаты исследования качественного и количественного состава сухого экстракта мякоти тыквы; методика количественного определения суммы гидроксипроизводных коричной кислоты в целевом продукте; ^ квантово-химическое обоснование антиоксидантной активности

4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты; ^ корреляционные зависимости между суммарной ненасыщенностью циннамоильного фрагмента в структуре производных коричной кислоты и проявляемой антиоксидантной активностью.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работ ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава», номер государственной регистрации 01.200101060.

Апробация работы и публикации.

Основные положения диссертационной работы изложены на: ^ четвертом международном симпозиуме "Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие интернет-ресурсы СМТР1-2007" (Москва, сентябрь 2007 года); конгрессе "Человек и лекарство" Краснодар -2008г.; > 63-й и 64-й научной конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2008-2009г.).

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе учебно-методическое пособие, используемое в учебном процессе факультета последипломного образования ПятГФА и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 138 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 160 источников, в том числе 65 иностранных; содержит 30 таблиц, 20 рисунков.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Целенаправленный поиск индивидуальных веществ и суммарных композиций, характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Предварительный биохимический скрининг сухих экстрактов, полученных из мякоти тыквы обыкновенной, показал, что наибольшей антиоксидантной и СОД-протекторной активностью обладает целевой продукт, полученный с использованием спирта этилового 70%. Данный экстрагент обеспечивает наибольшую концентрацию антиоксидантов — 174,9±2,4 мг/г (17,5%) в пересчете на кверцетин.

2. Осуществлен химический анализ сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, полученного экстракцией спиртом этиловым 70%, и в нем количественно охарактеризованы аминокислоты — 12,68 г/кг (1,27%); полисахариды: ВРПС - 3,36±0,12%, ПВ - 13,43±0,34%, ГцА - 9,89±0,21%, ГцБ - 5,44±0,14%; макро и микроэлементны - 48,78% (в пересчете на золу); аскорбиновая кислота — 3,98±0,13%; каротиноиды — 1,42±0,04мг/% (0,0014%).

3. Изучен полифенольный состав полученного сухого экстракта и установлено, что преобладающими в нем соединениями являются изоферуловая, кофейная, цикоревая, коричная, галловая кислоты, а также апигенин и кверцетин, содержание которых в сумме составляет 128,23 мг/г (12,82%).

4. Предложена методика количественного определения суммарного содержания производных коричной кислоты в исследуемом сухом экстракте, найдено 8,24±0,11% в пересчете на кофейную кислоту.

5. Использование дескрипторов, рассчитанных полуэмпирическими квантово-химическими методами РМЗ и AMI, позволило выявить наиболее реакционноспособные центры в циннамоильном фрагменте. Установлено, что взаимодействие коричной кислоты с гидроксильным радикалом в первую очередь происходит по виниленовому фрагменту (С7-С8) и далее в следующей последовательности С6, CI, С5.

6. Прогноз антиоксидантной активности для индивидуальных гидрокси- и метоксипроизводных коричной кислоты позволил обосновать наибольшую активность для 4-гидрокси-3,5,-ди-трет-бутилкоричной кислоты, что далее было подтверждено экспериментально её синтезом и анализом биологического действия.

7. Установлены иммунотропный эффект сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной, а именно увеличение IgM-антителогенеза (в дозе 100 мг/кг в 1,71 раза; в дозе 500 мг/кг — 1,85 раза относительно контроля), а также уменьшение воспалительного эффекта при введении разрешающей дозы антигена (в дозе 100 мг/кг на 9,4%, в дозе 500 мг/кг - 37,5% по отношению к контролю).

8. В эксперименте in vivo установлена протекторная активность сухого экстракта мякоти тыквы обыкновенной по отношению к эритроцитарной Cu, Zn - супероксиддисмутазе.

9. Сопоставление экспериментально найденных значений уровня антиоксидантной активности производных коричной кислоты с показателем суммарной ненасыщенности молекул, рассчитанным квантово-химическим методом, позволило выявить линейную зависимость между этими параметрами с коэффициентом корреляции 0,911.

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Агаджанян, Владимир Сергеевич

1. Абисалова, И.Л. Изучение радиопротекторного действия феруловойкислоты: автореф. дис. канд. фармац. наук: 14.00.25 / Абисалова

2. Ирина Леонидовна. — Пятигорск, 2004. — 20с.

3. Агаджанян, B.C. Применение квантово-химических методов анализа для интерпретации антирадикальной активности в ряду гидроксипроизводных коричной кислоты / B.C. Агаджанян, Э.Т. Оганесян // Хим. фармац. журн. - 2008. - Т.42, № 11. - С. 12-17.

4. Анионные конденсации 4-(2)-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилбензальдеги-дов в присутствии слабых оснований / В.Б. Вольева и др. // Журн. орган, химии. 2008. - Т. 44, вып. 6. - С.814-817.

5. Антиокислительная активность флавоноидов в различных системах перекисного окисления липидов / В.А. Костюк и др. // Биохимия. -1988. Т.53, № 8. - С. 1365-1370.

6. Антиоксидантная активность антигипоксантов, производных тиомочевины, тиадиазола и пиперазина в модельных системах in vitro / И.В. Зарубина и др. // Вопр. биол. мед. и фармац. химии. 2001. -№ 1.-С. 51-55.

7. Антиоксидантная активность сыворотки крови / Г.И. Клебанов и др. // Вестн. Рос. акад. мед. наук. 1999. -№ 2. - С. 15-22

8. Антиоксидантные свойства лекарственных растений / В.Ф. Громовая и др. // Хим. фармац. журн. - 2008. - Т.42, №1. - С. 26-29) '

9. Антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина / Г.И. Клебанов и др. // Вопр. мед. химии. 2001. - Т.47, № 3. - С. 5-12.

10. Афанасьев, И.Б. Кислородные радикалы в биологических процессах / И.Б. Афанасьев //Хим.-фармац. журн. 1985. - Т.19, № 1. - С. 11-23.

11. Биотест-системы для первичного скрининга и оценки действия веществ с антиоксидантной активностью / В.А. Дубинская и др. // Вопр. биол. мед. и фармац. химии. 2007. - № 4 - С. 47-52.

12. Вартанян, JI.C. Влияние ионола на метаболизм супероксидных радикалов в печени мышей / JI.C. Вартанян, С.М. Гуревич // Вопр. мед. химии. 1999. - Т.45, № 4. - С, 8-16.

13. Ветров, И.П. Определение содержания липофильных веществ и суммы каротиноидов в растительном сырье / П.П. Ветров, C.B. Гарная, Л.Г. Долганенко // Хим. фармац. журн. 1989. - Т.23, № 3. - С.23-25

14. Взаимодействие синглетного кислорода с биомолекулами. Тушение 02~* глицирретовой кислотой, изоликвиритигенином и их гликозидамиглицирризиновой кислотой и ликуразидом / H.H. Кабальнова и др. // Изв. АН., Сер. хим. 1996. - Т.45, № 1. - С. 57- 59.

15. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. — 252 с.

16. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров // Сорос, образ, журн. 2000. - Т.6, №12 - С. 13-19.

17. Владимиров, Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. — М.: Высш. шк., 1989.-199 с.

18. Влияние природного Мальтола на процесс пероксидного окисления липосомальных мембран / И.В. Бабенкова и др. // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 2001. -№ 4. - С. 22-25. ,

19. Влияние экзогенной супероксиддисмутазы на активность супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах у больных с острым гепатитом В / М.В. Коробова и др. // Рос. биомед. журн. -2001.-Т.5, №2.-С. 36-39.

20. Воейков, В. JI. Регуляторные функции активных форм кислорода вкрови и в водных модельных системах: автореф. дис.Д-ра биол.наук: 03.00.13; 03.00.02 / Воейков Владимир Леонидович. М., 2003. -44с.

21. Воейков, В. Л. Благотворная роль активных форм кислорода / В.Л. Воейков // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2001. - Т.11, № 4. - С. 128-135.

22. Газиев, А.И. Ликопин — потенциальное средство профилактики рака и сердечно-сосудистой патологии / А.И. Газиев // Вопр. биол. мед. и фармац. химии. — 2001. — № 3. — С. 3-9.

23. Горбунов, А.И. Синтез и окислительно-восстановительные реакции некоторых функциональных производных пространственногзатрудненных фенолов: автореф. дис. канд. хим. наук: 02.00.03

24. Горбунов Андрей Иванович. — Астрахань, 2008. 23с.

25. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье — 11 изд., доп. / МЗ СССР М.: Медицина, 1990.-Вып. 1,2.

26. Гуляева, Н.В. Механизм функционирования супероксиддисмутазы: многоцентровая модель / Н.В. Гуляева, А.Б. Обидин, Б.С. Маринов // Изв. акад. наук СССР. Сер. биол. 1989. - №6 - С. 890-898.

27. Двойное потенцирование ишемической болезни сердца- активными формами кислорода и антиоксиданты / А.Х. Коган и др. // Вопросы биол. мед. и фармац. химии. 2002. - №2. - С. 3-7.

28. Дмитриев, Л.Ф. О механизме взаимодействия токоферола с перекисными радикалами / Л.Ф. Дмитриев, М.И. Верховский // Биохимия. 1990. - Т.55, вып. 11 - С. 2025-2029.

29. Дмитриев, Л.Ф. Радикальные состояния и циклические превращения липидов в биологических мембранах: дис. . д-ра биолог, наук: 03.00.02/ Дмитриев Леонид Федорович. М., 1997. - 72с.

30. Дорожко, А.И. Хелатирующее и антирадикальное действие рутина в процессе перекисного окисления липидов микросом и липосом

31. А.И. Дорожко, A.B. Бродский, И.Б. Афанасьев // Биохимия. 1988. -Т. 53, № 10.-С. 1660-1666.

32. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс М.: Мир, 1991.-544 с.

33. Дурнев, А.Д. Роль свободных радикалов кислорода в мутагенных эффектах лекарств и других ксенобиотиков / А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Хим.-фармац. журн. 1990. - Т.24, № 10. - С. 7- 14.

34. Дьяков, A.A. Противоаритмическое действие феруловой кислоты / A.A. Дьяков, В.Н. Перфилова, И.Н. Тюренков // Вестн. аритмологии. -2005.-№39.-С. 49-52.

35. Дьякова, И.Н. Экспериментальное исследование церебропротекторныхсвойств феруловой кислоты в условиях ишемии мозга: автореф. дис.канд. фарм. наук: 14.00.-25 / Дьякова Ирина Николаевна. Пятигорск., 2007. - 24с.

36. Зайцев, В.Г. Модельные системы перекисного окисления липидов и их применение для оценки антиоксидантного действия лекарственныхпрепаратов: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.16; 03.00.02

37. Зайцев Валерий Геннадьевич. Волгоград, 2001. - 23с.

38. Зайцев, В.Г. Связь между химическим строением и мишенью действия как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г. Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский // Эксперим. клин, фармакология.- 2003- Т.66, № 4 С.66-70.

39. Запрометов, М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях / М.Н. Запрометов М.: Наука, 1993.-272 с.

40. Зиновьева, В.Н. Коррекция мутагенного действия кверцетина природными и синтетическими фенолсодержащими аминокислотами / В.Н. Зиновьева, A.A. Спасов // Вопросы биол. мед. и фармац. химии. 2005. — №1. — С. 45-47.

41. Зиятдинова, Г.К. Определение флавонолов в фармпрепаратах методом вольтамперометрии / Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Хим. фармац. журн. - 2005. - Т.39, №10. - С. 54-56.

42. Интернет-система прогноза спектра биологической активности химических соединений / В.В. Поройков и др. // Хим. фармац. журн. - 2002. - Т.36, №10. - С. 21-26.

43. Использование квантово-химических методов для обоснования антирадикального1 (ОН') действия полигидроксихалконов / Э:Т. Оганесян и др.*// Хим. фармац. журн. - 2002. - Т. 36', №12 - С. 21-25.

44. Исследование антиоксидантных свойств каталазы и супероксиддисмутазы методом вольтамперометрии / Е.И. Короткова и др. // Хим. фармац. журн. - 2008. - Т.42, №8. - С. 45-48. •

45. Исследование взаимосвязи структура — антиоксидантная активность в ряду флавоноидов. Антиаллергическая активность халконов / Э.Т. Оганесян и др. // Хим. фармац. журн. - 1991. - Т. 25, №8 — С. 18-22.

46. Ковалев, И.Е. Ковалентное связывание ксенобиотиков с белками организма как механизм адаптации / И.Е. Ковалев Н.В. Щипулина // Хим-фармац. журн. 1996 -Т.30, № 11. - С. 3-12. .

47. Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в надземной части Echinacea purpurea (L.) Moench / В. А. Куркин и др. // Раст.ресурсы. 1998. - Т.34, вып. 2. - С.81-85.

48. Компьютерный прогноз и направленный синтез нового производного бетулина, обладающего противотуберкулезным действием / А.В. Погребняк и др. // Хим. фармац. журн. - 2002. — Т. 36, №10 — С. 18-23.

49. Коренман, И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений / И.М. Коренман. — М.: Химия, 1975. — 360с.

50. Короткова, Е.И. Новый вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов / Е.И1 Короткова, Ю.А. Корбаинов, О.А. Аврамчик // "Биоантиоксидант"; тез. докл. VI междунар. конф. 16-19 апр. 2002 г. М., 2002. - С. 298-299.

51. Костюк, В. А. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцитина / В.А. Костюк, А.И. Потапович, Ж.В. Ковалева // Вопр. мед. химии. 1990. - Т.22, №2 - С. 88-91.

52. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных соединений / Н.К. Кочетков. М., 1970. - 486с.

53. Кулинский, В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред защита / В.И. Кулинский // Сорос, образ, журн. 1999. - №1 - С. 2-7.

54. Ландау, М.И. Неточности и ошибки, встречающиеся в работах, посвященных количественным соотношениям между структурой и биологической активностью химических соединений / М.И. Ландау //

55. Хим.-фармац. журн. 1982. - Т.16, № 9. - C.l 12-114.

56. Лужков, В.Б. Квантово-химические расчеты инибиторов окисления. I. Молекулярная структура, энергии связей и реакционная способность природных полифенолов из класса флавоноидов / В.Б. Лужков // Журн. орган, химии. 1991.-Т. 61, № 9.-С. 1937-1842.

57. Магин, Д.В. Простой метод измерения активности супероксиддисмутазы с помощью фотосенсибилизированной хемилюминесценции / Д.В. Магин, Г. Левин, И.Н. Попов // Вопр. мед. химии. 1999. - Т.45, №1. - С. 23-34.

58. Максименко, A.B. Внеклеточное оксидативное поражение сосудистой стенки и её ферментативная антиоксидантная защита / A.B. Максименко // Хим. фармац. журн. - 2007. - Т. 41, №5 - С. 3-12.

59. Мальцев, Ю.А. Применение квантово-химических методов для анализа антирадикальной активности флавоноидов и обоснования синтезаполигидроксихалкнов: автореф. дис. канд. фарм. наук: 15.00.02 /

60. Мальцев Юрий Александрович. — Пятигорск., 2000. 23с.

61. Матасова, С.А. Химический состав сухого водного экстракта из шрота шиповника / С.А. Матасова, Г.Л. Рыжова, К.А. Дычко // Химия растит, сырья. 1997. - Т.1, №2. - С. 28-31.

62. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: в 2 т. / М.Д. Машковский. 14-е изд., перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2000. - 2 т.

63. Методика определения антиоксилительной активности химических соединений / С.Г. Благородов и др. // Хим. фармац. журн. - 1987. -Т. 21, №3.- С. 292-294.

64. Минкин, В.И. Теория строения молекул / В.И. Минкин, Б.Я. Симкин, P.M. Миняев. Ростов-н/Д: Феникс, 1997. - 327с.

65. Новиков, К.Н. Роль активных форм кислорода в биологических системах при воздействии факторов окружающей среды: автореф.- дис. . д-ра биол. наук: 03.00.16; 03.00.02 / Новиков Кирилл Николаевич. -М., 2004.-46с.

66. О влиянии биологически активных веществ на антиоксидантную активность фитопрепаратов / Е.И. Шикарина и др. // Хим. фармац. журн. - 2001. - Т. 35, №6.- С. 40-47.

67. Оганесян, Э.Т. Исследования механизма реакции производных флавона с гидроксильным радикалом полуэмпирическими методами / Э.Т. Оганесян, Ю.А. Мальцев, Д.Е. Творовский // Журн. общей химии.-2001.-Т. 71, вып. 6.-С. 999-1005.

68. Определение антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья методом катодной вольтамперометрии / Е.И. Короткова и др. // Хим. фармац. журн. — 2003. - Т.37, №9. - С. 55-56.

69. Пат. 2139306 Российская федерация, С 09 В 61/00. Способ получения модифицированного каротиноидного красителя из растительного сырья / В.М. Болотов и др. (РФ). № 98114475/13; заявл. 20.07.1998; опубл. 10.10.1999, Бюл. №28.-4с.

70. Пат. 2238554 Российская Федерация, МКИ G01 N33/15 N27/26. Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ / В.П. Пахомов и др. (РФ). — № 2003123072/15; заявл. 25.07. 03; опубл. 20.10.04, Бюл. № 15. Зс.

71. Перфилова, В.Н. Кардиопротективное действие феруловой кислоты при стрессорном повреждении сердца / В.Н. Перфилова, A.A. Дьяков, И.Н. Тюренков // Эксперим. и клинич. Фармакология. 2005. - Т. 68, №5.-С. 19-22.

72. Подопригорова, В.Г. Оксидативно-антирадикальные параметры контроля течения бронхиальной астмы / В.Г. Подопригорова, A.A. Бобылев, Т.С. Максакова // Вопросы биол. мед. и фармац. химии. -2007. №4. - С. 44-49.

73. Применение никотинамида и других антиоксидантных препаратов в комплексной терапии сахарного диабета 2 типа / Н.И. Фадеева и др. // Сахарный диабет. 2001. - №1. - С. 16-22

74. Роль перекисного окисления в повреждении липидов мембран приишемии печени / Л.Б.Дудник и др. // Вопр. мед. химии. 1981. - № 3. -С.380 — 382.

75. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев и др. // Вопр. мед. химии. — 2000. — Т.46, №2 — С. 7-13.

76. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П. Фисенко, Е.В. Арзамасцева. — М.: Ремедиум, 2000. — 398 с.

77. Синтез производных халкона и качественная оценка корреляции структура-активность / Э. Т. Оганесян и др. // Хим. фармац. журн. -1986. Т.20, № 6. - С.696-702.

78. Сирота, Т.В. Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности-супероксиддисмутазы / Т.В. Сирота // Вопр. мед. химии. — 1999. — Т.45, №3.-С. 23-34.

79. Спектрофотометрическое определение гидроксикоричной кислоты и её производных в препаратах эхинацей / О. А. Запорожец и др. // Хим. фармац. журн.-2003.-Т.З7, № 12.-С. 11-14. *

80. Сравнительное изучение антиоксидантной активности витаминов А, Е и ß-каротина / И.В. Кутузова и др. // Фармация. 2004. — № 4. — С. 15-18.

81. Сучков, В.П. Биохимическая роль селена в организме животных / В.П. Сучков, Ц.М. Штутман, А.Г. Халмурадов // Укр. Биохим. Журн. 1978. - Т.50, № 5. С. 659-671.

82. Теоретический метод прогнозирования биологической активности суммарных растительных препаратов на основе алгоритма MATRIX / A.B. Погребняк и др. // Хим. фармац. журн. - 2004. - Т. 38, № 9. -С. 19-25.

83. Тимергазин, К.К. Квантово-химические расчеты энергии диссоциации связи С-Н в углеводородах, спиртах, и простых эфирах

84. K.K. Тимергазин, С.JT. Хурсан // Изв. АН. Сер. химич. 1996. - № 12.1. С.2858-2861.

85. Тимергазин, К.К. Энтальпии образования и прочности связей О-О и С-О в полиоксидах / К.К. Тимергазин // Изв. АН. Сер. химич. 1996. — № 9. - С.2190-2193.

86. Уротропиновый синтез производных 3,5-ди-трет-бутилсалициловой кислоты / В.Б. Вольева и др. // Журн. орган, химии. — 2007. — Т. 43, вып. 10.-С.1495-1498.

87. Филимонов, Д.А. Прогноз спектров биологической активности органических соединений / Д.А. Филимонов, В.В. Поройков // Рос. хим. журн. 2006. - Т.50, №2. - С. 66-75.

88. Хэнч, К. Об использовании количественных соотношений струкура — активность (КССА) при конструировании лекарств / К. Хэнч // Хим. -фармац. журн. 1980. - Т.14, №10. - С. 15-29.

89. Целенаправленный поиск веществ с заданными фармакологическими свойствами / Э. Т. Оганесян и др. // Кубанск. науч. мед. вестн. 2009.2. С.37-40.

90. Чугасова, В. А. Антиоксиданты природные и синтезированные / В.А. Чугасова // Косметика и медицина. — 1998. №2. - С. 18-23.

91. Шашкина, М.Я. Биодоступность каротиноидов / М.Я. Шашкина, П.Н. Шашкин, A.B. Сергеев // Вопр. мед. химии. 1999. - Т.45, №2 - С. 3246.

92. Электронное строение и химические превращения пероксидов. MINDO/3 расчеты геометрии и энтальпий образования основного состояния органических и элементоорганических перекисей / В. Н. Кокорев и др. // Журн. струк. химии. 1981. - Т. 22, № 4. -С.9-15.

93. Яшин, А.Я. Прибор для определения антиоксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков / А.Я. Яшин,

94. Я.И. Яшин // Журн. междунар. информационная система по резонансным технологиям — 2004. — №34. — С.10-14.

95. A quantum chemical explanation of the antioxidant activity of flavonoids/ Ven Acker S.A. et al. // Chem. Res. Toxicol. 1996. - Vol. 9. - P. 13051312.

96. Additional antilipoperoxidant activities of alpha-tocopherol and ascorbic acid on membrane-like systems are potentiated by rutin / Negre-Salvayre A. et al. // Pharmacology. 1991. - Vol. 42, № 5. - P. 262-272.

97. Agawal, R. Rapid, fluorimetric-liquid chromatographic determination of malondialdehyde in biological samples / R. Agawal, S.D. Chase // J. Gromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2002. - Vol. 775. -P.121-126.

98. AMI: A new general purpose quantum mechanical molecular model / MJ.S. Dewar et al. // J. Am. Chem. Soc. 1985. - Vol. 107. - P.3902 -3909.

99. Antioxidant activity of natural flavonoids is governed by number and location of aromatic hydroxyl groups / Chem Z.Y. et al.// Chemistry and physics of lipids. 1996. - Vol.79. - P. 157-163.

100. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: Structure-activity relationships / R.L. Prior et al. // Free Radic. Biol. Med. 1997. -№ 22. -P.749-760.

101. Antioxidant properties of hidroxy-flavones / N. Cotelle et al. // Free Radic. Biol. 1996.-Vol. 20.-P. 35-43.

102. Antioxidative activity of 5,6,7,8-tetrahydrobiopterin and its inhibitory effect on paraquat-induced cell toxicity in cultured rat hepatocytes / S. Kojima et al. //FreeRadic. Res. 1995. - Vol.23, №5. - P. 419-430.

103. Antioxidative effects of pumpkin seed (Cucurbita pepo) protein isolate in CC14-Induced liver injury in low-protein fed rats / C.Z. Nkosi CZ et al. // Phytother Res. 2006. - Vol.20, №11 - P. 935-940.

104. Antioxydant and pro-oxidant actions of flavonoids: effects on DMA damage induced by nitric oxide, peroxynitrite and nitroxyl anion / Ohshima H. et al.// Free Radic Biol Med. 1998. - Vol. 25, № 9. - P. 1057-1065.

105. Antiprotozoal activities determined in vitro and in vivo of certain plant extracts against Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum and Blastocystis sp. / E. Grabensteiner et al. // Parasitol Res. 2008. -Vol.103, № 6.-P.1257-1264.

106. Ascorbic acid conjugates isolated from the phloem of Cucurbitaceae / R.D. Hancock et al. // Phytochemistry 2008. - Vol.69, № 9. - P. 18501858.

107. Beyer, G. Effects of selected flavonoids and caffeic acid derivatives on hypoxanthine-xanthine oxidase-induced toxicity in cultivated human cells / G. Beyer, M.F. Melzig // Planta Med. 2003. - Vol. 69. - P. 1125-1129.

108. Cadenas, E. Basic mechanisms of antioxidant activity / E. Cadenas // Biofactors. 1997. - Vol.6, №> 4. -P.391-397.

109. Caili, F. A review on pharmacological activities and utilization technologies of pumpkin / F. Caili, S. Huan, L.Quanhong // Plant Foods Hum. Nutr. -2006. Vol.61, № 2. - P.73-80.

110. Chemical composition and antioxidant activity of an acidic polysaccharide extracted from Cucurbita moschata Duchesne ex Poiret / X. Yang et al. // J. Agric. Food Chem. 2007. - Vol.55, № 12. - P.4684-4690.

111. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes / H. Esterbauer et al. // Free Radic. Biol. Med. 1991. -№ 11. — P.81-128.

112. Chirico, S. High-performance liquid chromatography-based thiobarbituric acid tests / S. Chirico // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274, № 1. P.471-477.

113. Cooperation of quercetin with ascorbate in the protection of photosensitized lisis of human erytrocytes in the presence of hematoporhpyrin / Y. Sorata et al. // Photochem. and Photobiol. 1988. - Vol. 48, №2. - P. 195-199.

114. Cunningham, A. J. Studies on the cellular basis of IgM immunological memory. The induction of antibody formation in bone marrow' cells by primed spleen cells / Cunningham A.J. // Immunology 1969. - Vol.17, № 6.-P. 933-942.

115. Deng, W. Flavonoids function as antioxidants: by scavenging oxygen species or by chelating iron / W. Deng, X. Fang, J. Wu// Radiat. Phys. Chem. 1997.-Vol. 50.-P. 271-276.

116. Detection of free radicals produced from reactions of lipid hydroperoxide model compounds with Cu(II) complexes by ESR spectroscopy / J. Ueda et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - Vol.325, №1. - p. 65-67.

117. Discriminating between drugs and nondrugs by prediction of activity spectra for substances (PASS) /S. Anzali et al. // J. Med. Chem. 2001. - Vol. 44, № 15.-P. 2432-2437.

118. Dreikorn, K. The role of phytotherapy in treating lower urinary tract symptoms and benign prostatic hyperplasia / K. Dreikorn // World J. Urol-2002. Vol.19, № 6. - P.426-435.

119. Efficacy of hypochlorous acid scavengers in the prevention of protein carbonyl formation / M.G. Traber et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - Vol.327, №2 - P. 330-334.

120. Essentiality of the active-site arginine residue for the normal catalytic activity of Cu, Zn superoxide dismutase /С. L. Borders et al. // Biochem. J. 1985.-Vol. 230-P. 771-776.

121. Evaluation and comprasion of two improved techniques for the on-line detection of antioxidants in liquid chromatography eluates / A.J. Dapkevicius et al. // Chromatog. 2001. - Vol. 912 - P. 73-82.

122. Extraction and chromatography of carotenoids from pumpkin / J.S. Seo et al. // J Chromatogr. A. 2005. - Vol.73, № 2. - P.371-375.

123. Finkel, T. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. / T. Finkel, NJ. Holbrook // Nature. 2000. - Vol. 408(6809). - P. 239• 247.

124. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies/ Bors W. et al. // Methods Enzymol. 1990. - Vol. 186. - P. 343-355.

125. Floyd, R.A. Free radical damage to protein and DNA: mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress / R.A. Floyd, J.M. Carney //Ann. Neurol. 1992. - № 32. - P. 22-27.

126. Frankel, E.N. Formation of malonaldehyde from lipid oxidation products / E.N. Frankel, W.E. Neff// Biochim. Biophys. Act. 1983. - Vol. 754. -C.264-270.

127. Hadaroglu, H. Antioxidant and radical scavenging properties of Iris Germanica / H. Hadaroglu, Y. Demir, N. Demir // Хим. фармац. журн. -2007.- T.41, №8. - С. 13-18.

128. Halliwell, В. Antioxidant defence mechanisms: from the beginning to the end (of the beginning) / B. Halliwell // Free Radic. Res. 1999. - Vol. 31, №4.-P. 261-272.

129. Halliwell, B. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview / B. Halliwell, J.M. Gutteridge // Methods Enzymol. 1990. -Vol. 186-P. 80-85.

130. Hanasaki, Y. The correlation between active oxygen scavenging and antioxidative affects of flavonoids / Y. Hanasaki, S. Ogawa, S. Fukui // Free Radic. Biol. Med. 1992. - Vol. 16. - P.605-608.

131. In vitro antioxidant properties of Cucurbita pepo L. male and female flowers extracts / L. Tarhan et al. // Plant Foods Hum. Nutr. 2007. - Vol.62, № 2. -P.49-51.

132. Iron coordination by catechol derivative antioxidants / T. Kawabata et al. // Biochem. Pharmacol. 1996. - Vol. 51, №11. - P. 1569-1577.

133. Jung Hoon Kang Modification and inactivation of human Cu, Zn -superoxide dismutase by methylglyoxal / Jung Hoon Kang // Mol. Cells. -2003. Vol. 15, №2 - P. 194-199.

134. Knight, J.A. Specificity of the thiobarbituric acid reaction: its use in studies of lipid peroxidation / J. A. Knight, R.K. Pieper, L. McClellan // Clin. Chem. 1988. - Vol.34. - P.2433-2438.

135. Liebler, D.C. Antioxidant reactions of beta-carotene: identification of carotenoid-radical adducts / D.C. Liebler, T.D. McClure // Chem. Res. Toxicol. 1996.-Vol. 9, № 1. — P.8-11.

136. McCord, J.M. An enzyme-based theory of obligate anaerobiosis: the physiologicalfunction of superoxide dismutase / J. M. McCord, B.B. Keele, I. Fridovich // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. - Vol. 68, № 5. - P. 10241027.

137. McCord, J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein / J. Ml McCord, I. Fridovich // The J. of Biolog. Chem. -1969. Vol. 244, № 22 - P. 6049-6055.

138. Misra, Hara P. The generation of superoxide radical during the autoxidation of hemoglobin / Hara P. Misra, I. Fridovich // The J. of Biolog. Chem. -1972. Vol. 247, № 21. - P. 6960-6962.

139. Patel, M. Metalloporphyrin class of therapeutic catalytic antioxidants / M. Patel, B J. Day // Trends Pharmacol. Sci. 1999. - № 20. - P. 359-364.

140. Peyrat-Maillard, M.N. Determination of the antioxidant activity of phenolic compounds by coulometric detection / M.N. Peyrat-Maillard, S. Bonnely, C. Berset//Talanta. -2000. Vol.51, № 4. - P. 709-716.

141. Raha, S. Mitochondria, oxygen free radicals, disease and ageing. / S. Raha, B.H. Robinson // Trends Biochem. Sci. 2000. - Vol. 25, №10. -P. 502- 508.

142. Ramakrishnan, N. Ebselen inhibition of apoptosis by reduction of peroxides / N. Ramakrishnan, J.F. Kalinich, D.E. McClain // Biochem. Pharmacol. -1996.-Vol. 51, № 11.-P. 1443-1451.

143. Rice-Evans, C.A. Current status of antioxidant therapy / C.A. Rice-Evans, A.T. Diplock // Free Radic. Biol. Med. 1993. - № 15. - P. 77-96.

144. Sarkar, S. Effect of ripe fruit pulp extract of Cucurbita pepo L. in aspirin induced gastric and duodenal ulcer in rats / S. Sarkar, D. Buha // Indian J. Exp. Biol.- 2008. Vol.46, № 9. - P.639-645.

145. Sies, H. Biological redox systems and oxidative stress / H. Sies // Cell. Mol. Life Sci.-2007.-Vol.64, №17- P. 2181-2188.

146. Sinner, M. The chromatographic behavior of polysaccharides / M. Sinner, J.J. Puis // J. Chromatogr. 1978. - Vol. 156, №1. - P. 194-204.

147. Stewart, J.J.P. Optimization of parametrs for semi-empirical methods. AM1-Metod / J.J.P. Stewart // J. Comp. Chem. 1989. - Vol. 10. - P. 221-223.

148. Subcellular localization of superoxide dismutase in rat liver / P.J. Chantal et al. // Biochem. J. 1975. - Vol. 150 - P. 31-39.

149. Synergistic antioxidative effects of tocopherol and ascorbic acid in fish oil / H.Q. Shin et al. // J. Am. Oil Chem. Soc. 1991. - Vol. 5, № 8. - P. 881-883.

150. Synergistic interactions between vitamin A and vitamin E against lipid peroxidation in phosphatidylcholine liposomes / L. Tesoriere et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1996. - Vol. 326, № 1. - P. 57-63.

151. Tadolini, B. Carvedilol inhibition of lipid peroxidation. A new antioxidative mechanism / B. Tadolini, F. Franconi //Free Radic. Res. 1998. - Vol. 29, № 5. - P. 377-387.

152. The dark side of dioxygen biochemistry / J.S. Valentine et al. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. - №2. - P. 253-262.

153. Uchida, K. Identification of oxidized histidine generated at the active site of Cu, Zn-superoxide dismutase exposed to H202 / K. Uchida, S. Kawakishi// The J. of Biolog. Chem. 1994. - Vol. 269, № 4. - P. 2405-2410.

154. Validation of analytical procedure: methodology Q2B / Intern, conf. on for human use. Geneva: ICH Secretariat, 1996. - 8 p.1. УТВЕРЖДАЮ»1. АКТ О ВНЕДРЕНИИ

155. Предмет внедрения: Получение биологически активной субстанций из мякоти плодов тыквы обыкновенной (Cucurbita pepo L.)

156. Кем предложен: Агаджанян B.C. аспирант кафедры органической химии ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии, Россздрава.

157. Источник информации: Материалы диссертационной работы B.C. Агаджаняна «Целенаправленный поиск индивидуальных и суммарных веществ, характеризующихся антиоксидантной активностью»

158. Кем и где выдано: Научно-исследовательский институт питания Российской академии медицинских наук, г. Москва, Устьинский проезд, дом 2/14

159. Цель внедрения: Расширение ассортимента и структуры отечественных БАД к пище и фитопрепаратов лечебного и профилактического назначения.

160. Ответственные за внедрение: старший научный сотрудник ПИИ питания РАМН- СУХАНОВ Борис Петрович профессор, доктор медицинских наук

161. Подпись руки ^се^е^е/^о^ /Ь /7"

162. Кем предложен: Агаджанян B.C. аепирант кафедры органической химии ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава

163. Источник информации: Материалы диссертационной работы B.C. Агаджаняна

164. Целенаправленный попек индивидуальных и суммарных веществхарактеризующихся антирадикальной активностью, в отнощенни супероксидного анион-радикала».

165. Кем и где выдано: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

166. Цель внедрения: Дальнейшее более rjrv6nmPиилее глубокое химико-аналитическоефармакологическое изучение предлагаемой субстанции.

167. Ответственные за внедрение: заведующая лабораторией микросомального окисления д.б.н. И.И. Карузина

168. Зав. лаб. микросомального окисления, д.б.н.1. И.И. Карузина

169. УТВЕРЖДАЮ» Ректо^ГОУ ВПО «Пятигорская ¡ая фармацевтическая Росздрава»1. М.В. Гаврилин 2009 г.1. АКТ О ВНЕДРЕНИИ

170. Предмет внедрения: Научно-исследовательская работа, по применению методик квантово-химических расчетов для прогнозирования антирадикальной активности соединений, а также результаты экспериментального изучения антиоксидантной активности.

171. Кемпредложен: Агаджанян B.G. аспирант кафедры органической химии ПятГФА, Муцуева С. X. доцент кафедры фармации ФИО, кандидат фармацевтических наук

172. Источник информации:; Материалы диссертационной работы B.C. Агаджаняна «I Целенаправленный поиск индивидуальных и суммарных веществ- характеризующихся антирадикальной активностью в отношении супероксидного анион-радикала»

173. Кем и где выдано: г. Пятигорск, факультет последипломного образования1 при Пятигорской государственной фармацевтической академии Росздрава,

174. Ответственные за внедрение: Денисенко ОЛН., декан факультета последипломного образования; доктор фармацевтических наук, профессор;

175. Результаты внедрения: ' По результатом научно-исследовательской работы составлено учебно-методическое пособие «АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ПРИРОДНЫЕ АНТИОСКСИДАНТЫ»