Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Совершенствование технологии лекарственных форм бифидумбактерина

На правах рукописи

ЛЕМЕШЕВА МАРИНА ИВАНОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ БИФИДУМБАКТЕРИНА

15.00.01- технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь-2005

Работа выполнена в Филиале ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Томское НПО «Вирион» и в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ»

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, доцент

Молохова Елена Игоревна

кандидат медицинских наук

Несчисляев Валерий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

Вдовина Галина Петровна

кандидат фармацевтических наук

Шилова Людмила Борисовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет МЗ РФ»

Защита состоится 22 февраля 2005 г., в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48.

С диссертацией можно познакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ».

Автореферат разослан января 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Метелева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема дисбиотических состояний в настоящее время является весьма актуальной для медицины и требует практических решений, связанных с необходимостью организации массового производства пробиотических препаратов, предназначенных для коррекции микрофлоры человека (Алешкин, 2002; Грачева, 1999;Шендеров 2002).

Одним из эффективных средств лечения и профилактики дисбактерио-зов является препарат бифидумбактерин. Традиционной формой выпуска этого пробиотика является лиофилизированная биомасса бифидобактерий во флаконах, что не в полной мере отвечает современным требованиям фармацевтического рынка. Повышение потребительских свойств препарата предполагает выпуск широкого спектра лекарственных форм бифидумбактерина, в том числе порошков и капсул. К достоинствам последних следует отнести: удобство при приеме, транспортировке и хранении, а также безопасность вследствие отказа от стеклянной упаковки.

Для совершенствования технологии лекарственных форм необходим стабильный по технологическим и биологическим свойствам лиофилизат бифи-добактерий, что связано с усовершенствованием процессов накопления и высушивания биомассы.

Выраженная чувствительность бифидобактерий к действию биологических жидкостей определяет актуальность использования технологических приемов, направленных на повышение устойчивости препарата при перораль-ном приеме (Пучнин, 1988; Несчисляев, 2004).

Необходимость исследований, направленных на усовершенствование технологии пероральных лекарственных форм бифидумбактерина, определила актуальность проведенной работы.

Цель и задачи исследований - разработка технологии и стандартизация пероральных дозированных лекарственных форм на основе сухой биомассы бифидобактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- усовершенствовать процесс периодического культивирования бифидо-бактерий в биореакторе и разработать экономичную производственную питательную среду,

- подобрать составы защитных сред для улучшения технологических параметров сухой биомассы бифидобактерий,

- изучить влияние иммобилизации клеток с использованием геля алюминия гидрооксида на биологические и технологические свойства сухой биомассы бифидобактерий,

- выбрать вспомогательные вещества и разработать составы дозированных порошков и капсул бифидумбактерина,

- оценить качество полученных лекарственных форм.

Научная новизна. Установлены закономерности развития популяции штамма Bifidobacterium bifidurn 1 в процессе управляемого рН-статируемого

периодического культивирования в биореакторе: продолжительность и кинетические особенности фаз роста. Определена оптимальная продолжительность (12-14 ч.) процесса глубинного культивирования и разработана эффективная питательная среда для получения биомассы бифидобактерий.

Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства бифидобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы. Предложены новые варианты составов защитных сред с учетом специфики получения различных лекарственных форм бифидобактерий. Получена лиофили-зированная ацидорезистентная биомасса иммобилизованных бифидобактерий для использования в технологии дозированных порошков.

Разработан состав наполнителей для лиофилизата бифидобактерий, позволяющий получать однородную смесь для дозирования в пакеты и капсулы, обладающую низкой гигроскопичностью и удовлетворительной сыпучестью.

Практическая значимость работы. Усовершенствованы процессы производственного культивирования и лиофильного высушивания бифидобак-терий, позволяющие получать сухую биомассу, пригодную для изготовления различных лекарственных форм бифидумбактерина.

Показана возможность использования в крупномасштабном производстве экономичной соево-дрожжевой среды для выращивания бифидобактерий, мо-лочно-дрожжевой и сахарозо-молочной сред для стабилизации бактериальной суспензии (акт внедрения от 10.09.04 г.).

Разработана технология дозированных порошков в пакетах и капсулах на основе оптимизированной по биологическим и технологическим свойствам сухой биомассы бифидобактерий.

На основании проведенных исследований разработаны:

регламент производства №1485-04 «Бифидумбактерин сухой», экспериментально-производственный регламент № 1213-02 «БифоВир порошок», ФСП 42-0135328602 «БифоВир порошок», инструкция по применению препарата «БифоВир порошок», проекты ФСП «Бифидумбактерин капсулы» и инструкции по применению препарата «Бифидумбактерин капсулы».

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Современная гастроэнтерология и проблемы заболеваний органов пищеварения XXI» (Томск, 1999); "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", (Томск, 2001); «Достижения современной гастроэнтерологии», (Томск, 2002); «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы» ( Пермь, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003); Международной научно-практической конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Томск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. Связь задач исследования с проблемным планом научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ филиала ФГУП «НПО «Мик-роген» МЗ РФ «Томское НПО «Вирион» и ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия МЗ РФ» (№ гею. peг. 01.91001873). На защиту выносятся:

- усовершенствование производственного процесса выращивания бифидобак-терий на основе особенностей их жизнедеятельности и состава питательных сред при периодическом управляемом рН-статируемом культивировании,

- исследование влияния различных ксеропротекторов на биологические свойства и технологические параметры лиофилизированной биомассы бифидобак-терий,

- обоснование состава вспомогательных веществ и способа их введения для улучшения технологических свойств лиофилизата бифидобактерий,

- разработка технологии и стандартизация дозированных порошков и капсул с бифидобактериями.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 таблицами и 27 рисунком. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 литературных источника, из них 144 отечественных и 75 зарубежных авторов, 7 приложений на 17 страницах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложены актуальность, цели и задачи исследований, научная новизна, практическая значимость работы.

В первой главе обобщены литературные данные о значении и функции нормальной микрофлоры человека, роли в ней бифидобактерий. Изложены сведения о пробиотиках, в том числе на основе бифидобактерий, освещены технологические аспекты производства, пути их совершенствования и перспективы создания новых лекарственных форм бифидосодержащих пробиоти-ков.

Во второй главе дана характеристика производственного штамма Bifidobacterium bifidum 1. Перечислены и охарактеризованы использованные в работе препараты, питательные среды, вспомогательные вещества. Приведено описание основных методов исследования биологических, физико-химических и технологических свойств сухой биомассы и порошков.

Усовершенствование процесса периодического культивирования бифидо-бактерий в биореакторе (глава 3).

Для установления закономерностей накопления биомассы бифидобакте-рий были изучены показатели роста культуры В. ЫМиш 1 в процессе периодического реакторного культивирования.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

время,час

■ общее число «леток по стандарту мутности —♦— количество жизнеспособных »лето« бифидобаитерий

Рис.1 Полулогарифмические кривые изменения оптической плотности и концентрации жизнеспособных бифидобактерий в процессе культивирования

На основании полученных данных была построена полулогарифмическая кривая изменения оптической плотности, по которой были определены основные фазы роста культуры бифидобактерий (рис 1)

В анализируемом процессе лаг-фаза продолжалась четыре часа. Экспоненциальная фаза фиксировалась в интервале с 4 по 12 ч роста культуры, между 12 и 14 ч наблюдали фазу замедленного роста, которая сменялась стационарной. Концентрация жизнеспособных клеток к 12-13 ч процесса культивирования достигала максимума и составляла 4-6 х109 КОЕ/мл, далее наблюдалось падение количества жизнеспособных клеток.

На основании полученных данных были рассчитаны и проанализированы основные показатели роста бифидобактерий: удельная скорость роста культуры по оптической плотности, удельная скорость /ислотообразования.

Было отмечено, что в промежутке между 9-10 и 11-13 ч культивирования происходит снижение удельной скорости роста бифидобактерий, а рост удельной активности кислотообразования увеличивается, что свидетельствует об активизации метаболических процессов в популяции бактерий

Рис2. Изменение удельной скорости роста бифидобактерий по оптической плотности

С учетом выявленных закономерностей роста культуры были проведены исследования по определению оптимальной продолжительности процесса культивирования. Для этого через каждый час с 9-го по 16-й ч культивирования отбирали пробы, которые подвергали лиофилизации. В полученных образцах определяли количество жизнеспособных клеток до и после высушивания, а также в процессе хранения в течение 15 мес (табл.1).

Таблица 1

Сохранение жизнеспособности бифидобактерий при лиофилизации и в процессе хранения в зависимости от времени культивирования

Снижение коли-

Время, Час

Количество жизнеспособных клеток, КОЕ (М±т)

До лиофклиза-шш (М*т)х108

После лиофилизации (М±т)хЮ'

После 15 мес. хранения (М±т) хЮ*

честна КОЕ, % (М±т)

9ч

20,б± 1,28

0,224±0,002

0,05±0,012

77,68±0,88

10 ч

29,6±0,88

0,48±0,006

0,21±0,018*

56Д5±1,44

11ч

39,6±0,72

0,8 8± 0,048

0,52*0,037'

40,91±0,88

12 ч

54,8±0,72

4,82 ±0,06

4,11±0,152 *

14,74±0,64

13 ч

58±0,8

5,02±0,104

4,27±0,184

14,95*0,88

14 ч

54,6±0,72

5,14±0,048

4,34±0,14

15,57±0,72

15 ч

50,4±0,88

0,88 ±0,032

0,474±0,01

53,3±4,3

16 ч

49,8±0,64

0,86 ±0,088

0,23±0,008

33^±13

Примечание: - р< 0,05, -р>0,05 по отношению к предыдущему показателю

Анализ полученных данных выявил существенные различия исследуемых образцов по степени отмирания клеток при хранении. Установлено, что при длительном хранении наибольшие количества (84-85 %) живых клеток сохраняется в образцах, взятых на 12,13,14 ч культивирования с содержанием (4-5) хЮ8 КОЕ/доза после лиофилизации.

С учетом этого была выбрана оптимальная продолжительность периодического культивирования бифидобактерий - 12-14 часов, позволяющая получать стабильную по биологическим свойствам сухую массу бифидобактерий.

Следующий этап наших исследований включал выбор рациональных источников углеводного питания и значений рН в процессе периодического культивирования бифидобактерий.

Результаты исследований показали (табл. 2), что параметры роста культуры бифидобактерий в процессе культивирования с добавлением лактозы, глюкозы, глюкозо-лактозной смеси не имеют достоверных различий по показаниям удельной скорости роста, времени генерации, приросту биомассы и выживаемости бифидобактерий в бактериальной суспензии (р > 0,05).

Таблица 2

Показатели роста культуры бифидобактерий при использовании углеводных добавок различного состава

Углеводы, используемые в процессе культивирования Длительность культивирования, ч Параметры роста культуры бифидобактерий (М±ш)

Удельная скорость роста, ч'1 Время генерации, Ч Прирост биомассы бифидобактерий, % Выживаемость бифидобактерий в бактериальной суспензии, КОЕ/мл

Лактоза 13,0±1,0 0,266*0,01 2,602±0,069 69,06±1,7 (4,5±0,19) хЮ9

Глюкоза 13,0±1,0 ОД58±0,064 2,680±0,068 70,1±1,12 (4,14±0,45) хЮ5

Глюкозо-лактозная смесь 13,0±1,0 0,270^,012 2,768±0,248 70,46±1,11 (4,8±0,41) хЮ®

При сравнительном анализе кривых удельной скорости роста бифидобак-терий при различных значениях рН было выявлено, что во всех вариантах (рН-5,2, рН - 6,5, рН-7,0) параметры роста культуры практически не отличаются. Максимальная удельная скорость роста при всех значениях рН наблюдается между 4-м и 9-м ч культивирования. Показатели количества жизнеспособных клеток в бактериальной культуре достоверно не различались между собой (р > 0,05).

Проведенные исследования показали возможность использования в производственном процессе выращивания бифидобактерий в качестве источника углеводного питания лактозы, глюкозы и их сочетаний при значении рН куль-туральной среды в диапазоне 5,2-7,0.

В настоящее время для накопления биомассы в производстве бифидум-бактерина предусмотрено использование казеино-дрожжевой среды (КД № 5). Применение в составе питательной среде гидролизата казеина не является оптимальным как по длительности приготовления, так и по себестоимости данного полуфабриката. Была изучена возможность замены гидролизата казеина на бульон, приготовленный на основе соевой муки.

При разработке соево-дрожжевой среды дрожжевой субстрат применяли в виде дрожжевого аутолизата, приготовленного регламентированным способом, дрожжевой массы без аутолиза и дрожжевого осадка после аутолиза. Содержание аминного азота во всех исследуемых вариантах среды составляло (1,4 ±0,2) мг/мл. В качестве контроля использовали среду КД № 5, а также варианты сред, содержащих монооснову - соевой бульон или дрожжевой аутоли-зат.

Установлено, что достаточно высокими ростовыми свойствами обладают питательные среды, содержащие в своем составе как моно - так и поликомпонентную основу. При сравнении питательных сред близких по составу, но различных по технологии, показано, что лучшими ростовыми свойствами обладает соево-дрожжевая среда, содержащая дрожжевой аутолизат, которая по удельной скорости роста и времени генерации практически не отличалась от казеиново-дрожжевой. Достоверных различий не имели показатели прироста биомассы и выживаемости бифидобактерий в бактериальной взвеси (табл.3).

По результатам электронной микроскопии установлено, что культура бифидобактерий, выращенная на соево-дрожжевой среде имеет вид типичных слегка изогнутых палочек с булововидными или шаровидными утолщениями на одном или двух концах.

Таким образом, экспериментально доказано, что разработанная соево-дрожжевая среда не уступает по эффективности регламентированной, более проста в изготовлении и экономична, что подтверждает целесообразность ее использования в производстве бифидумбактерина.

Таблица 3

Культивирование бифидобактерий в биореакторе на питательных средах _различного состава_

Питательная среда Длительность культивирования Параметры роста культуры бифидобактерий (М±ш)

Удельная скорость роста, ч Время генерации, ч Прирост биомассы бифидобактерий, % Выживаемость бифидобактерий в бактериальной суспензии,^ КОЕ/мл

Соево-дрожжевая среда 14,0*1,0 0,296*0,033' 2,39*0,25* 75,38*2,55 * 9,54*0,13 *

Казеиново-дрожжевая среда (контроль) 14,0*1,0 0,287*0,02 2,43±0,20 74,91*2,04 9,52*0,13

---^-----

Примечание: - р>0,05 по отношению к казеиново-дрожжевой среде (контроль)

Получение и исследование технологических и биологических свойств сухой биомассы бифидобактерий (глава 4).

Данный раздел исследований был связан с модификацией состава регламентированной защитной сахарозо-желатино-молочной - (СЖМ) среды для стабилизации бактериальной суспензии в процессе лиофилизации. Изменение состава ксеропротектора диктовалось необходимостью исключения или снижения количества дорогостоящих компонентов (желатин, сахароза), а также улучшения технологических свойств сухой биомассы.

При получении традиционной лекарственной формы препарата в виде сухой биомассы во флаконах была апробирована молочно-дрожжевая среда (МД), содержащая в качестве структуропротективного компонента нативный дрожжевой аутолизат (замена желатина). Данный вариант защитной среды, на который оформлена заявка на изобретение (№ 2004105687/13 (005928) от 25.02.2004 г.), обеспечивает необходимые физические свойства сухого бифи-думбактерина и не уступает по эффективности регламентированному ксеро-протектору.

В процессе организации массового производства бифидумбактерина в виде дозированных порошков и капсул возникает ряд технологических проблем, связанных с высокой гигроскопичностью и низким показателем сыпучести сухой биомассы бифидобактерий. Для улучшения данных показателей была использована сахарозо-молочная (СМ) среда со сниженным в 2 раза содержанием сахарозы.

Результаты исследований физико-химических и технологических свойств лиофилизатов бифидобактерий, приготовленных с применением СЖМ и СМ сред, показали, что исключение структурообразующего компонента (желати-

и

на) улучшает технологические свойства сухую микробную массу бифидобак-терий (СБ) не в достаточной степени.

Учитывая способность аэросила и геля алюминия гидроксида (ГАГ) образовывать с водными растворами структурированные системы, была исследована возможность введения их в состав ксеропротектора.

Для изучения влияния аэросила и ГАГ на биологические и технологические свойства сухой биомассы были апробированы различные варианты защитных сред (табл. 4).

Таблица 4

Составы бактериальных суспензий для лиофилизации

№ варианта Бактериальная взвесь Состав защитных сред

Нативная бактериальная взвесь Бактериальная взвесь с ГАГ, соотношение Обезжиренное молоко Сахароза Желаягин Аэросил, %

1 - 1:1 + + + -

2 - 1 0,5 + + + -

3 - 1 0,2 + + + -

4 - 1 0,2 + + + 3

5 - 1 0,2 + + - -

б - 1 0,5 + + - -

7 + + + - б

8 + + + - 9

9 + _ + + - 12

В полученных образцах сухой микробной массы изучали показатели специфической активности - содержание количества КОЕ бифидобактерий в 0,1 г лиофилизата и активность кислотообразования - интегрального параметра, который характеризует биохимическую и антагонистическую активность бифидобактерий.

Проведенные исследования показали, что введение в состав защитных сред аэросила и ГАГ во всех вариантах, кроме варианта 1, обеспечивает высокую выживаемость бифидобактерий при лиофильном высушивании. Показатели выживаемости (варианты 2 - 9) достоверно не отличались по отношению к контролю. Аналогичные результаты были получены при сравнении показателей активности кислотообразования и безвредности (табл. 5).

Таблица 5

Характеристика биологических показателей лиофилизатов _бифидобактерий_

Варианты Выживаемость бифидобактерий, lg КОЕ /0,1 гр, (М±ш) Активность кислото-образования °Т, (М±т) Безвредность

1 8,10±0,13' 128,66±9,4Г Безвреден

2 8,34±0,14 * 147,66±8,32 * Безвреден

3 8,41±0,11 * 142,54±3,69 * Безвреден

4 8,46±0,1 * 146,16±4,49* Безвреден

5 8,49*0,08 * 150,9±7,29 * Безвреден

6 8,36±0,14* 143,64*9,09* Безвреден

7 8,36±0,08 * 142,28±2,82 * Безвреден

8 8,33±0,05 * 148,5±3,72" Безвреден

9 8,31±0,1Г 140,56±3,11 * Безвреден

Контроль 8,46±0,1 146,84± 4,07 Безвреден

Примечание: - р <0,05; - р >0,05 относительно контроля.

Известно, что желчь и желудочный сок обладают бактерицидным действием и служат факторами неспецифической антибактериальной защиты организма. Устойчивость к действию биологических жидкостей является одним из основных требований к современным пробиотикам для перорального применения. Одним из способов, позволяющим снизить неблагоприятное воздействие биологических жидкостей на бифидобактерий, является иммобилизация клеток, в том числе на геле алюминия гидроксида.

Для изучения устойчивости к биологическим жидкостям лиофилизатов бифидобактерий были отобраны образцы, содержащие в своем составе ГАГ. Результаты исследований, представленные на рис. 2, свидетельствуют о высокой чувствительности не иммобилизованных бифидобактерий к действию желудочного сока и желчи. Так, после двухчасового контакта с желудочным соком содержание живых бифидобактерий в биомассе закономерно снижалось не менее чем на пять порядков. Снижение выживаемости на три порядка была выявлена при исследовании действия желчи медицинской.

Составы

состав 1 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:1) с СЖМ ср;

состав 2 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,5) с СЖМ ср;

состав 3 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотошении (1:0,2) с СЖМ ср;

состав 4 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,2) с СЖМ ср + 3% аэросила;

состав 5 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,2) с СМ ср;

состав 6 - бактериальная взвесь с ГАГ в соотношении (1:0,5) с СМ ср

контроль - бактериальная взвесь бифидобактерий с СМ средой

О исходное содержание жизнеспособных клеток § количество жизнеспособных клеток после экспозиции в желчи б количество жизнеспособных клеток после экспозиции в желудочном соке

Рис.3 Сохранение выживаемости бифидобактерий при воздействии

желудочного сока и желчи

При изучении выживаемости бифидобактерий, иммобилизованных на ГАГ, была установлена их выраженная устойчивость к действию желудочного сока и желчи. После контакта с желудочным соком и желчью исходное содержание жизнеспособных бактерий в экспериментальных образцах снижалось не более чем на один порядок.

Результаты данного этапа исследования показали, что все варианты лио-филизатов бифидобактерий, приготовленные с различными составами защитных сред, соответствуют регламентированным требованиям по основным биологическим показателям. Иммобилизация бактериальных клеток на микроносителе - ГАГ повышает устойчивость лиофилизатов бифидобактерий к разрушающему действию желудочного сока и желчи, что свидетельствует о перспективности разработки технологии лекарственных форм на его основе.

При изучении технологических свойств лиофилизатов бифидобактерий (табл.6) установлено, что введение ГАГ и аэросила в состав СЖМ защитной

среды практически не изменяет технологических свойств сухой биомассы. Добавление ГАГ и аэросила в различных концентрациях при использовании СМ среды улучшает показатели сыпучести и насыпной плотности, однако вла-гопоглощающая способность биомассы остается высокой.

По совокупности результатов исследований биологических и технологических свойств лиофилизатов бифидобактерий для дальнейшего изучения дозированных порошков были отобраны варианты сухой биомассы (составы № 5 - 6), приготовленных с применением СМ среды и ГАГ.

Таблица 6

Технологические характеристики лиофилизатов бифидобактерий с различным составом защитных сред

« Состав лиофилизета Сыпучесть, г/с Насыпная плотность, кг/м3 (М±т) Прирост влаги после 48 часов экспозиции, % (М±т)

5 6 и t (М*т) При ф=78,8% (М±т) При «¡1=100% (М±т)

I Б/б: гель гидроксида алюминия (ГАГ) (1:1) в СЖМ ср. Отсутствует 368*14 12,40*0,13 33,60*0,11

2 Б/б: ГАГ( 1:0,5) в СЖМ ср. Отсутствует 312*15 15,00*0,11 31,00*0,13

3 Б/б: ГАГ (1:0,2) в СЖМ ср. Отсутствует 390*14 13,65*0,10 28,00*0,16

4 Б/б: ГАГ (1:0,2) +3% аэросила в СЖМср Отсутствует 380*10 13,48*0,15 27,50*0,13

5 Б/б: ГАГ(1 ОД) в СМср 2,39*0,08 448*25 15,10*0,13 26,50*0,12

6 Б/б: ГАГ( 1:0,5) в СМср 2,45*0,12 469*10 14,90*0,16 25,70*0,15

7 Б/б+6%аэросила в СМср 3,6*0,1 484*10 16,30*0,12 33,60*0,11

8 Б/б+9%аэросила в СМср 4,0*0,12 490*12 16,45*0,11 34,40*0,12

9 Б/б+12%аэросила в СМср 4,7*0,14 500*15 17,10*0,14 37,40*0,16

10 Бифиаумбактерин (СЖМ ср) (контроль) Отсутствует 403*20 12,30*0,11 32,50*0,13

11 Бифидумбакгерин (СМ ср) (контроль) 2,1*0,16 439*20 13,00*0,11 32,00*0,11

ф - относительная влажность воздуха Б/б "бактериальная взвесь бифидобактерий

Получение и стандартизация дозированных порошков и капсул бифидобакте-рий (глава 5).

Для повышения технологических свойств проведен подбор вспомогательных веществ-влагорегуляторов, обеспечивающих снижение гигроскопичности и улучшение сыпучести сухой биомассы бифидобактерий.

В качестве вспомогательных веществ использовали лактозу, аэросил, микрокристаллическую целлюлозу, композиции - магния оксида с крахмалом и лактозу с аэросилом. Образцом сравнения служила сухая микробная биомасса бифидобакте-рий (СБ), приготовленная с добавлением СМ среды.

При оценке гигроскопичности по степени поглощения влаги в эксикаторе с влажностью 78,8 и 100% установили, что наименьшие показатели прироста соответствуют лактозе, а также композиции лактозы с аэросилом.

Для изучения влияния лактозы и аэросила на технологические свойства лио-филизата СБ смешивали в различных соотношениях с этими веществами до получения однородной порошкообразной массы. Составы изученных порошков представлены в табл.7.

Нами были построены изотермы сорбции влаги составами 4,5,6,9,10, указанные в таблице 7, в качестве образца сравнения использовали СБ (изотерма 1). Представленные на рис. 4 результаты эксперимента позволили сделать вывод, что с увеличением влажности сорбция воды составами, включающими лактозу (изотермы 4,5), идет с меньшей скоростью и остаточная влажность таких порошков в 2-4 раза ниже, чем лиофилизатов с аэросилом (изотермы 9,10). Сравнение композиций, содержащих 6 % аэросила (изотермы 9 и 10) показало, что добавление аэросила в состав порошка на этапе смешивания с СБ более эффективно по сравнению с введением совместно с защитной средой. Наименьшие абсолютные значения остаточной влажности были отмечены у состава с добавлением лактозы и 1% аэросила (изотерма 6).

состав 4 - лиофилизат бифвдобактерий с лактозой в соотношении 1:1;

состав 5 - лиофилизат бифвдобактерий с лактозой в соотношении 12;

состав 6 - лиофилизат бифвдобактерий с лактозой в соотношении 1:2+1% аэросила;

состав 9 - лиофилизат бифидобактерий + 6 % аэросила;

состав 10 - лиофилизат бифидобактерий+6 % аэросила в защитной среде.

состав 1 - лиофилизат бифидобактерий (контроль)

Рис. 4 Изотермы сорбции влаги поверхностью порошков бифидумбактерина с различными напонителями

На основании сравнительного изучения технологических свойств порошков бифидумбактерина (табл. 7) установлено, что неудовлетворительную сыпучесть имел состав 3 , допустимую - составы 2,7,8, удовлетворительную сыпучесть - составы 1,4,5,6,9. Высокие показатели насыпной плотности показали составы 1,4,5,6.

При анализе показателей гигроскопичности исследуемых порошков низкая влагопоглощающая отмечена у составов 5 и 6. Наибольшая гигроскопичность выявлена у состава 9, содержащего 6% аэросила.

Таблица7

Технологические характеристики порошков бифидумбактерина, содержащих

лактозу и аэросил

ев л Сыпучесть, г/с (Mim) Насыпная плот- Прирост влаги после 24 часов экспозиции, %

в о и * Состав порошка ность, кг/м3 (М±т) При <¡>=78,8% (М±т) При ф=100% (М±т)

1 СБ +лакгоза(2:1 )+3% аэросила 3,8±0,9 750±20 8,45±0,11 13,14±0,П

2 СБ +лактоза(2:1)+6% аэросила 2,5±0,3 625±15 8,24±0,11 12,90*0,10

3 СБ +лактоза(2:1)+9% аэросила 1,5±0,4 518±25 8,46±0,10 23,05±0,15

4 СБ+лактоза(1:1) 4Д±0,4 64Ш0 7,80±0,14 16,50±0,13

5 СБ +лактоза(1:2) 5,0±1,0 73 5± 15 5,75±0,16 14,ЗОЮ,10

б СБ+лактоза( 1:2)+1 % росила аэ- 5,2±0,8 781±20 5,50*0,13 13,17±0,14

7 СБ+лактоза( 1:2)+3% росила аэ- 2,3±0Д 545±20 9,00±0,12 13,40±0,11

8 СБ+лактоза(1:2)+5% росила аэ- 2,0±1,2 450±14 10,50±0,11 16,90±0,16

9 СБ +6% аэросила 4,5±1Д 572±25 11,85±0,18 17,20±0,13

10 СБ +6% аэросила в щитной среде за- 3,6±1,0 484±14 16,30±0,12 33,60*0,11

11 СБ (контроль) 2,1±0,9 439±12 13,00±0,11 32,00±0,11

ф - относительная влажность воздуха

СБ - сухая микробная биомасса бифидобактерий

Для определения оптимального количества аэросила, которое позволяло бы получать сыпучую, неотсыревающую и неуплотняющую в процессе хранения смесь, было изучено влияние его разных концентраций на сыпучесть лиофилизата бифидобактерий в сочетании с лактозой. Из рассмотренных вариантов порошков наибольшую сыпучесть показал состав, содержащий СБ с лактозой в соотношении 1:2, с добавлением 1% аэросила. Указанный состав отличается относительно низким влагопоглощением.

Таким образом, в результате изучения модельных порошков бифидумбак-терина по показателям сыпучести, насыпной плотности и гигроскопичности было установлено, что наиболее оптимальными технологическими характеристиками обладает смесь лиофилизата бифидобактерий и лактозы в соотношении (1:2) с добавлением 1% аэросила от общей массы порошка. Указанный состав был выбран в качестве производственного варианта при получении дозированных порошков и капсул. С учетом специфической активности бифидобактерий доза порошка в 1 пакете (капсуле) составила 0,35 г.

В качестве первичной упаковки для препарата «БифоВир порошок» использовали пакеты из комбинированного материала на основе полиэтиленовой пленки и фольги по ТУ 1119-007-00472673-96 (двухслойный материал) и пакеты на основе бумаги, полиэтиленовой пленки и фольги по ТУ 1811-007-46221433-98 (трехслойный материал) .Для капсулирования - твердые желатиновые капсулы № 0 типа «Озт^т^' (Бельгия), размер которых был определен расчетным путем (табл.8).

Таблица 8

Выбор оптимального размера капсул

№ капсулы Средняя емкость, м3 Объем, который занимает 0,35 г порошка, % Свободный объем капсулы, %

000 1,3 39,85 60,15

00 0,95 54,47 45,53

0 0,68 80,29 19,71

1 0,5 >100 -

2 0,37 >100 -

3 0,3 >100 -

4 0,21 >100 -

5 0,13 >100 •

Стабильность полученных препаратов «БифоВир порошок» и «Бифидумбак-терпн капсулы» определяли при хранении в сухом, защищенном от света месте, при температуре (8±2) С в течение 1 года 3 месяцев. В процессе хранения образцы препаратов периодически (с интервалом в 3 месяца) подвергали внешнему осмотру и оценивали по показателям подлинности, специфической активности, растворимости (для пакетов) или распадаемости (для капсул), средней массе, показателю рН, потери в массе при высушивании, безвредности, отсутствию посторонних микроорганизмов и грибов (для пакетов) или микробиологической чистоте (для капсул).

На основании экспериментальных данных установили, что при хранении в течение 1 года 3 месяцев дозированные порошки в обоих вариантах упаковки и капсулы не изменяют своих свойств и удовлетворяют предъявляемым к ним требованиям по всем показателям. Это позволило определить срок хранения для данных лекарственных форм бифидумбактерина-1 год.

Результаты проведенных экспериментов использованы при разработке технологических схем производства дозированных порошков бифидумбакгерина в пакетах и капсулах. На рис.,JT представлены схемы производства пероральных дозированных препаратов бифидумбакгерина по существующей и предлагаемой технологиям.

Новая технология предусматривает использование в производстве экономичной соево-дрожжевой среды для выращивания бифидобактерий и МД и СМ сред для стабилизации суспензии. Выращивание производственной культуры бифидо-бактерий в условиях периодического управляемого рН-статируемого культивирования позволяет получать нативную бактериальную взвесь с активностью 4-6x109 КОЕ/мл. 1 литр такой бактериальной взвеси соответствует 625 дозам препарата. Выполнение технологических операций, связанных с получением дозированных порошков в пакетах и капсулах предусматривает использование представленных в настоящей работе технологических решений.

ВЫВОДЫ

1. На основании изученных закономерностей развития популяции штамма Bifidobacterium bifidum 1 определена оптимальная продолжительность (12-14 часов) процесса управляемого рН-статируемого периодического культивирования в биореакторе для получения биомассы бифидобактерий с максимальным содержанием жизнеспособных клеток.

2. Разработан состав и способ получения питательной среды, содержащей соевый бульон и дрожжевой аутолизат. Обоснована возможность ее использования для выращивания бифидобактерий в производственных условиях.

3. При изучении влияния природы ксеропротекторов на биологические и технологические параметры лиофилизированной биомассы бифидобактерий предложены варианты молочно-сахарной и молочно-дрожжевой защитных сред для получения пероральных лекарственных форм бифидумбактерина. Разработан способ получения ацидорезистентной лиофилизированной биомассы бифидобактерий, иммобилизованной на геле алюминия гидроксида для использования в технологии дозированных порошков.

4. Экспериментально обоснован состав наполнителей для лиофилизата бифи-добактерий, позволяющий получать однородную смесь для дозирования в пакеты и капсулы, обладающую низкой гигроскопичностью и удовлетворительной сыпучестью: сухая биомасса бифидобактерий - 0,117 г, лактоза -0,230 г, аэросил - 0,003 г.

5. Разработаны технология и показатели стандартизации дозированных порошков в пакетах и капсулах на основе сухой биомассы бифидобактерий.

6. Оформлены и утверждены ФСП 42-0135328602 «БифоВир порошок», экспериментально-производственный регламент №1213-02 «БифоВир порошок», регламент производства №1485-04 «Бифидумбактерин сухой». Разработаны проекты ФСП и регламента производства на препарат «Бифидумбактерин капсулы».

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Демешева М.И. Оптимизация процесса репродуцирования бифидобакте-рий для создания новых лекарственных форм / М.И. Демешева, Л.Н. Мезенцева, Л.Н. Полещук и др. // Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов: Тез. докл. - Томск, 2001.- С.51-54.

2. Лимарева Т.Д. Пробиотические микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования / Т.Д. Лимарева, М.И. Демешева //Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии - 2002.-№14. -С 113-116.

3. Демешева М.И. Создание новой лекарственной формы бифидумбакте-рина - препарата «Бифовир» в порошке / М.И. Демешева, Л. Н. Мезенцева, Т.Д. Лимарева //Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии - 2002.- №14. - С 162..

4. Молохова Е.И. Влияние вспомогательных веществ на технологические свойства лиофилизата бифидобактерий / Е.И. Молохова, М.И. Демешева, ВАНесчисляев // Мат-лы. межвуз. конф. ПГФА, 2002.- С.71.

5. Молохова Е.И. Выбор рационального состава дозированных порошков с бифидобактериями / Е.И. Молохова, М.И. Демешева // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Мат-лы всеросс. науч. конф.- Пермь, 2003. - С. 286-288.

6. Демешева М.И. Подбор и конструирование питательных сред для выращивания бифидобактерий /М.И. Демешева, В.А.Несчисляев // Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке: Мат-лы всеросс. науч. конф.- Пермь, 2003. - С. 290-293.

7. Молохова Е.И. Технологические аспекты капсулирования бифидобактерий / Е.И. Молохова , М.И. Демешева , Ю.В. Савицканите // Мат-лы межвуз. конф. ПГФА, 2003.- С. 140-141.

8. Демешева М.И. Биотехнологические аспекты производства бифидосо-держащих пробиотиков / М.И. Демешева, В.А. Несчисляев , Е.И. Молохова // Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы: Мат-лы межд. конф.- Москва, 2004.- С183-184.

9. Молохова Е.И. Разработка состава капсулированной лекарственной формы с бифидобактериями / Молохова Е.И., Демешева М.И., Несчисляев ВА // Сибирский медицинский журнал.- 2004-Т.19, №2 -С.58-59.

10.Демешева М.И. Опыт производства пробиотиков и перспективы развития в НПО «Вирион» г. Томск / М.И. Демешева // Сибирский медицинский журнал.- 2004-Т.19, №2 -С.100-102.

/' > - «

Тираж 100. Заказ 40. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

64

Актуальность

Начало XXI века характеризуется неблагоприятной экологической обстановкой, возрастанием стрессовых воздействий и ряда других факторов, которые оказывают отрицательное влияние на здоровье населения. С этим связывают увеличение частоты возникновения дисбиотических состояний у людей различных возрастных групп. Поддержание и восстановление нормального биоценоза микрофлоры человека является важной и актуальной задачей здравоохранения [37,96, 138].

Бифидобактерии, как важнейшие представители симбиотического микробиоценоза организма человека, широко используются в составе пробиотиков медицинского назначения для коррекции дисбактериозов желудочно-кишечного тракта [45]. Одним из эффективных средств для восстановления нормального биоценоза является известный препарат бифидумбактерин. Высокий количественный уровень бифидофлоры и ее преобладание в микробиоценозе, достигаемые при применении бифидумбактерина, нормализуют деятельность желудочно-кишечного тракта, улучшают обменные процессы, препятствуют формированию затяжных форм кишечных заболеваний, повышают неспецифическую резистентность организма [28,142].

Бифидобактерии являются ' постоянным объектом исследований в микробной экологии человека. Клинические исследования открывают новые стороны позитивного воздействия препаратов, содержащих бифидобактерии, при различных заболеваниях, что позволяет расширять сферу их применения [16,85]. Это диктует необходимость проведения исследований как по созданию новых лекарственных форм бифидумбактерина, так и по усовершенствованию технологических приемов его приготовления.

Для совершенствования технологии лекарственных форм необходим стабильный по технологическим и биологическим свойствам лиофилизат бифидобактерий, получение которого связано с изысканием оптимальных условий культивирования штамма Bifidobacterium bifidum 1 в биореакторе, повышением эффективности накопления биомассы и сохранением жизнеспособности клеток.

Реальные условия крупномасштабного производства пробиотиков диктуют необходимость повышения его эффективности за счет снижения трудоемкости и материальных затрат на всех этапах технологического процесса. Питательные среды и ксеропротекторы относятся к тем факторам, которые определяют качество бифидумбактерина и влияют на его себестоимость. Исследования, связанные с разработкой питательных и защитных сред с оптимальным сочетанием показателей эффективности и экономичности, должны способствовать снижению себестоимости производимой продукции при одновременном сохранении ее качественных характеристик.

В настоящее время большинство отечественных пробиотиков выпускается в виде лиофильно высушенной биомассы во флаконах, что не в полной мере отвечает современным требованиям фармацевтического рынка. Для повышения их потребительских свойств необходима организация массового производства этих препаратов в виде порошков и капсул. Такие лекарственные формы приняты в настоящее время для многих зарубежных пробиотиков [45]. Выраженная чувствительность бифидобактерий к действию биологических жидкостей определяет актуальность использования технологических приемов, направленных на повышение устойчивости клеток при получении лекарственных форм для перорального приема бифидосодержащих пробиотиков [76,131]. Получение дозированных порошков на основе иммобилизованных клеток можно рассматривать как один из способов повышения ацидорезистентности пробиотических препаратов.

В связи с вышеизложенным, исследования, направленные на разработку и усовершенствование всех этапов технологии указанных фармакопейных форм препарата на основе живых бифидобактерий, являются актуальными для производства пробиотиков.

Цель настоящего исследования — разработка технологии и стандартизация пероральных дозированных лекарственных форм на основе сухой биомассы бифидобактерий.

В соответствии с поставленной целью решались следующие основные задачи:

1. Усовершенствование процесса периодического культивирования бифидобактерий в биореакторе.

2. Разработка новых производственных питательных сред для бифидобактерий.

3. Изучение влияния иммобилизации клеток и ксеропротекторов на биологические й технологические свойства сухой биомассы бифидобактерий.

4. Подбор вспомогательных веществ и разработка составов дозированных порошков и капсул бифидумбактерина.

5. Оценка качества полученных лекарственных форм бифидумбактерина.

Научная новизна исследований

Установлены закономерности развития популяции штамма Bifidobacterium bifidum 1 в процессе управляемого рН-статируемого периодического культивирования в биореакторе: продолжительность фаз роста, наличие в экспоненциальной фазе роста периода, который отличается более низким значением удельной скорости роста и более высокой активностью кислотообразования. Определена оптимальная продолжительность процесса глубинного культивирования для получения биомассы бифидобактерий с максимальным содержанием жизнеспособных клеток.

Изучено влияние различных ксеропротекторов на биологические свойства бифидобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы.

Разработан способ получения лиофилизированной биомассы иммобилизованных бифидобактерий, обладающей повышенной ацидорезистентностью. Показана возможность использования указанной биомассы в технологии дозированных порошков.

Разработан состав наполнителей для лиофилизата бифидобактерий, позволяющий получать однородную смесь для дозирования в пакеты и капсулы, обладающую низкой гигроскопичностью и удовлетворительной сыпучестью.

Практическая значимость

Усовершенствованы процессы культивирования бифидобактерий и их лиофильного высушивания, позволяющие получать биомассу, пригодную для изготовления различных лекарственных форм бифидумбактерина.

Показана возможность использования в крупномасштабном производстве экономичной соево-дрожжевой среды для выращивания бифидобактерий, молочно-дрожжевой и сахарозо-молочной сред для стабилизации бактериальной суспензии. Предлагаемые среды не уступают по показателю эффективности регламентированным производственным средам.

Разработана технология крупносерийного производства дозированных порошков в пакетах и капсулах на основе сухой биомассы бифидобактерий. На основе разработанной технологии получены препараты «БифоВир порошок» и «Бифидумбактерин капсулы», отвечающие требованиям Фармакопейных статей на данные лекарственные формы.

Результаты научной работы отражены в нормативной документации:

- ФСП 42-013 5328602 «БифоВир порошок».

- Проект ФСП «Бифидумбактерин капсулы».

Экспериментально-производственный регламент № 1213-02 «БифоВир порошок ».

- Регламент производства № 1485-04 «Бифидумбактерин сухой».

- Инструкция по применению препарата «БифоВир порошок».

- Проект инструкции по применению препарата «Бифидумбактерин капсулы».

Положения, выносимые на защиту

1. Усовершенствование производственного процесса выращивания бифидобактерий на основе особенностей их жизнедеятельности и состава питательных сред при периодическом управляемом рН-статируемом культивировании.

2. Исследование влияния различных ксеропротекторов на биологические свойства бифидобактерий и технологические параметры лиофилизированной биомассы.

3. Обоснование состава вспомогательных веществ и способа их введения для улучшения технологических свойств лиофилизата бифидобактерий.

4. Разработка технологии дозированных порошков, капсул и стандартизация полученных лекарственных форм.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Современная гастроэнтерология и проблемы заболеваний органов пищеварения XXI», Томск, 1999; "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", Томск, 2001; «Достижения современной гастроэнтерологии», Томск, 2002; «Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы», Пермь, 2002; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в

XXI веке», Пермь, 2003; Международной научно-практической конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004. Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании кафедры «Промышленной технологии лекарств с основами биотехнологии» Пермской государственной фармацевтической академии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура работы

Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 22 таблиц и 26 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав экспериментальных исследований, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 219 литературных источника, из них 144 отечественных и 75 зарубежных авторов.

129 ВЫВОДЫ

1. На основании изученных закономерностей развития популяции штамма Bifidobacterium bifidum 1 определена оптимальная продолжительность (12-14 часов) процесса управляемого рН-статируемого периодического культивирования в биореакторе для получения биомассы бифидобактерий с максимальным содержанием жизнеспособных клеток.

2. Разработан способ получения питательной среды, содержащей соевый бульон и дрожжевой аутолизат. Обоснована возможность ее использования для выращивания бифидобактерий в производственных условиях.

3. При изучении влияния природы ксеропротекторов на биологические и технологические параметры лиофилизированной биомассы бифидобактерий предложены варианты молочно-сахарозной и молочно-дрожжевой защитных сред для получения пероральных лекарственных форм бифидумбактерина.

Разработан способ получения ацидорезистентной лиофилизированной биомассы бифидобактерий, иммобилизованной на гели алюминия гидроксида для использования в технологии дозированных порошков.

4. Экспериментально обоснован состав наполнителей для лиофилизата бифидобактерий, позволяющий получать однородную смесь для дозирования в пакеты и капсулы, обладающую низкой гигроскопичностью и удовлетворительной сыпучестью. Установлен оптимальный состав пакетов и капсул с бифидобактериями (0,350 г): сухая биомасса бифидобактерий - 0,117, лактоза - 0,230, аэросил - 0,003.

5. Разработаны технология и показатели стандартизации дозированных порошков в пакетах и капсулах на основе сухой биомассы бифидобактерий.

6. Оформлены и утверждены ФСП 42-0135328602 «БифоВир порошок», экспериментально-производственный регламент №1213-02 «БифоВир порошок», регламент производства №1485-04 «Бифидумбактерин сухой», разработаны проекты ФСП и регламента производства на препарат «Бифидумбактерин капсулы».

130