Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии и стандартизация лекарственных средств антимикробного действия из травы посконника конопляного

АВТОРЕФЕРАТ
Разработка технологии и стандартизация лекарственных средств антимикробного действия из травы посконника конопляного - тема автореферата по фармакологии
Шевченко, Анастасия Игоревна Пятигорск 2009 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.01
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка технологии и стандартизация лекарственных средств антимикробного действия из травы посконника конопляного

На правах рукописи

ШЕВЧЕНКО АНАСТАСИЯ ИГОРЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ ТРАВЫ ПОСКОННИКА КОНОПЛЯНОГО

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

003459057

ПЯТИГОРСК 2009

003459057

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Сампиев Абдулмуталип Магаметович Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Андреева Ирина Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор Молчанов Геннадий Иванович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «11» февраля 2009 года в часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава

Автореферат разослан « Л9 _» (Ж/уСи _200§, г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Устойчивая тенденция роста заболеваний инфекционными дерматозами стимулирует поиск новых эффективных и безопасных антимикробных средств. Наряду с целесообразностью получения оригинальных синтетических средств, перспективным направлением остается разработка антимикробных препаратов из новых видов растительного сырья. Большинство фитопрепаратов не обладают сенсибилизирующим действием, характеризуются наличием широкого спектра антибактериальной активности и слабой резистентностью по отношению к ним патогенных микроорганизмов. К сожалению, ассортимент зарегистрированных антимикробных фитопрепаратов в настоящее время крайне ограничен, несмотря на их высокую востребованность в дерматологии, особенно при длительно протекающих хронических формах болезней. Одним из традиционных путей поиска антимикробных средств растительного происхождения является анализ опыта народной медицины. В частности, имеются сведения о наличии антимикробных свойств у травы посконника и применении её в народной медицине в форме настоев для лечения инфекционных заболеваний кожи. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос по фотохимическому составу травы посконника, отсутствуют данные о биологически активных веществах (БАВ), обуславливающих её антимикробное действие.

Учитывая достаточную распространенность посконника конопляного в различных регионах РФ, в первую очередь Северного Кавказа, и возможность его введения в культуру, представлялось целесообразным рассмотреть это растение в качестве потенциального источника получения лекарственных средств антимикробного действия. Расширение и уточнение данных о составе содержащихся в траве посконника БАВ способствовало бы решению этой задачи. При этом, установление группы веществ, определяющих антимикробное действие травы посконника, является необходимым условием для разработки рациональной технологии и обоснованного нормирования качества создаваемого фитосредства и его лекарственной формы.

Таким образом, фармакогностическое и технологическое изучение травы посконника конопляного, получение из этого сырья лекарственных средств антимик-

робного действия, представляют собой в совокупности актуальное для фармацевтической науки исследование.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение БАВ травы посконника, получение из неё сухого экстракта, разработка технологии и нормирование качества экстрактсодержащей мази антимикробного действия.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

провести фитохимическое исследование травы посконника конопляного и определить содержание в сырье основных групп БАВ;

провести макроскопический и микроскопический анализ травы посконника; выявить группу БАВ, определяющую антимикробное действие травы посконника;

с учетом результатов фармакогностического исследования и выявленной группы БАВ антимикробного действия провести нормирование качества растительного сырья;

предложить ориентированные на действующие вещества технологию и нормы качества сухого экстракта травы посконника, изучить условия и сроки его хранения;

разработать состав, технологию и нормы качества антимикробной мази, содержащей сухой экстракт травы посконника конопляного.

Научная новизна. Проведен микроскопический анализ травы посконника конопляного и выявлены основные диагностические признаки: эпидермис листа с сильноизвилистыми тонкими стенками; устьица погруженные, аномоцитного типа, с нижней стороны более многочисленные; верхняя и нижняя стороны листа покрыты 3-6-клеточными простыми волосками; над жилками и по краю листа волоски колен-чатоизогнутые; по обеим сторонам листа имеются также округлые железки с бесцветным, сильнопреломляющим в отраженном свете содержимым;

В траве посконника обнаружено 17 аминокислот в свободном (11,0 мг%) и связанном (38,27 мг%) состояниях, из которых 4 относятся к незаменимым, а также определен макро- и микроэлементный состав. Установлен монозный состав и коли-

чественное содержание пектиновых веществ (3,85%) и водорастворимых полисахаридов (4,84%). Впервые в данном сырье обнаружено и количественно определено содержание п-кумаровой (0,57%), галловой (0,16%), феруловой (0,08%), янтарной (0,008%), яблочной (0,16%) и лимонной (0,67%) кислот. Установлено количественное содержание в траве посконника суммы фенолкарбоновых (2,19%) и органических (3,61%) кислот, кумаринов (0,21%), флавоноидов (0,64%) и дубильных веществ (6,12%).

На основании корреляционного сопоставления результатов микробиологического и фитохимического анализа фракций БАВ из травы посконника установлено, что веществами, определяющими антимикробное действие данного растительного сырья, являются фенолкарбоновые кислоты. Осуществлены исследования по стандартизации и предложены нормы качества травы посконника конопляного с учетом выявленных действующих веществ.

Для количественной селективной оценки содержания фенолкарбоновых кислот в траве посконника в присутствии флавоноидов предложено использовать сочетание прямой и дифференциальной спектрофотометрии.

Установлено, что наилучшей экстрагирующей способностью по отношению к фенольным соединениям травы посконника является спирт этиловый 95%.

Определены способ и условия получения сухого экстракта травы посконника конопляного. Обоснован выбор и применен метод вакуум-фильтрационного экстрагирования сырья в технологии сухого экстракта травы посконника, позволивший на уровне 96%-ой эффективности извлечь фенолкарбоновые кислоты. Предложено включить в перечень нормируемых показателей качества сухого экстракта травы посконника содержание фенолкарбоновых кислот (не менее 14%).

Предложена мазь, содержащая сухой экстракт травы посконника, проведены исследования по разработке ее состава и технологии. Установлено, что 2% мазь сухого экстракта травы посконника обладает антимикробным действием по отношению к ряду грамотрицательных и грамположительных штаммов микроорганизмов.

Практическая значимость результатов исследования. Проведенные фито-химические, товароведческие исследования, установленные в ходе макро- и микро-

скопического анализа травы посконника характерные диагностические признаки, позволили разработать проект ФСП на траву посконника конопляного.

Выявленные действующие вещества травы посконника - фенолкарбоновые кислоты позволили отнести их к основному нормируемому показателю качества сырья и получаемых лекарственных средств, ориентировать на них технологию сухого экстракта, включая стадии экстракции и очистки, осуществить выбор оптимального состава и стандартизацию экстрактсодержащей мази.

Разработанная методика количественного определения суммы фенолкарбоно-вых кислот в траве посконника и получаемых из неё лекарственных средствах позволяет дифференцировано и более объективно, в сравнении с применяемыми методиками, оценивать их содержание.

Разработанный оптимальный состав, технология и нормирование качества, установленная стабильность при хранении в течение 18 месяцев, а также выраженность антибактериального действия предложенной мази с сухим экстрактом травы посконника создают необходимые условия для серийного производства этой лекарственной формы.

Степень внедрения. По результатам исследований разработан лабораторный регламент на производство сухого экстракта травы посконника конопляного и проект ФСП: «Трава посконника конопляного» (акт внедрения ООО «Кубаньлектравы» от 11.12.06 г.). Методики оценки качества и предложенные технологии фитопрепаратов травы посконника апробированы в отделах контроля качества и производственных цехах ООО «Кубаньлектравы» (акт апробации от 24.11.06 г.), ЗАО «Роскар-фарм» (акт апробации от 17.12.06 г.). Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс фармацевтического факультета ГОУ ВПО КГМУ Рос-здрава (акт внедрения от 22.04.08 г.).

Основные положения, выносимые на защиту: результаты фармакогностического исследования и нормирования качества травы посконника конопляного;

данные по выявлению БАВ, содержащихся в траве посконника и обеспечивающих её антимикробное действие;

итоги исследования по разработке технологии и нормированию качества сухого экстракта травы посконника конопляного;

результаты исследования по разработке состава, технологии, стандартизации мази с сухим экстрактом травы посконника и предложения по его использованию.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на II и IV региональных научно-практических конференциях молодых ученых и студентов юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (Анапа, 2004 и 2006 гг.); 60-й региональной научной конференции по фармации и фармакологии «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (г. Пятигорск, 2005 г.); Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фармацевтической науки и практики» (Запорожье, 2006 г.), региональном конгрессе «Человек и лекарство. Краснодар - 2008» (г. Краснодар, 2008 г.).

По результатам исследований опубликовано 11 работ, в том числе в рекомендуемых ВАК журналах - 3 работы.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО КГМУ Росздрава (№ гос. регистрации 0120.0500289).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной объектам и методикам исследований, 4-х глав собственных исследований, выводов, а также списка литературы, включающего 176 наименований, в т.ч. 36 источников иностранных авторов. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 47 таблиц и 25 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Фитохимическое исследование основных групп БАВ в траве посконника конопляного

В исследованиях использовали траву посконника конопляного, заготовленную

в Краснодарском и Ставропольском краях в июле-ав1усте 2003-2006 гг.

Траву посконника подвергали фотохимическому анализу, применяя методы спектрофотометрии, капиллярного электрофореза, хроматографии, титриметрии, атомно-абсорбционной спектрометрии. Для количественной оценки флавоноидов и фенолкарбоновых кислот использовали разработанную нами методику. Она включает на первом этапе определение суммы флавоноидов посредством дифференциального спектрофотометрирования их комплекса с алюминия хлоридом в среде подкисленного спиртового раствора при длине волны 410 нм (в пересчете на рутин). Затем количество фенолкарбоновых кислот в пересчете на п-кумаровую кислоту устанавливают прямым спектрофотометрическим методом при длине волны 325 нм, используя найденное ранее содержание флавоноидов и принцип аддитивности. Вали-дационный анализ разработанной методики по «специфичности», «линейности», «точности», «воспроизводимости» и «достоверности» показал отсутствие систематической ошибки и подтвердил возможность ее использования для количественного определения фенолкарбоновых кислот. Количество кумаринов определялось методом прямой спекгрофотомерии в хлороформном растворе при длине волны 310 нм (в пересчете на кумарин). Остальные группы соединений в траве посконника устанавливали фармакопейными методиками. Статистически обработанные результаты количественного определения БАВ в шести образцах сырья, отличающихся местом сбора, представлены в обобщенном виде в таблице 1.

Таблица 1 — Содержание основных групп БАВ в траве посконника конопляного

Сумма и отдельные группы БАВ Количественное содержание, (х± Ах)*,%

Образец №1 Образец №2 Образец №3 Образец №4 Образец №5 Образец №6

Экстрактивные вещества, извлекаемые 95% спиртом этиловым 17,3±0,49 16,8±0,47 17,1±0,43 17,0±0,36 17,2±0,38 16,9±0,39

Флавоноиды 0,66*0,023 0,62±0,02б 0,65±0,025 0,63±0,028 0,64±0,023 0,62±0,021

Фенолкарбоновые кислоты 2,22±0,035 2,16±0,041 2,19±0,036 2,18±0,030 2,21±0,041 2,17±0,041

Кумарины 0,24±0,010 0,19±0,009 0,22±0,008 0,21 ±0,007 0,23±0,009 0,20±0,008

Органические кислоты 3,62±0,054 3,75±0,058 3,48±0,051 3,60±0,053 3,72±0,055 3,50±0,052

Дубильные вещества 6,35±0,098 5,99±0,086 6,01±0,073 6,19±0,09Г 5,20±0,074 5,97±0,072

Водорастворимые полисахариды 6,21±0,09 4,55±0,06 5,35±0,09 4,83±0,07 5,48±0,08 4,84±0,07

Пектиновые вещества 5,17±0,06 3,80±0,09 4,34±0,08 3,85±0,0б 4,36±0,07 3,82±0,07

* - результаты пяти определений

С использованием капиллярного электрофореза (прибор «Капель- 103Р») обнаружены: в составе флавоноидов - хризин (0,036%), рутин (0,26%), кверцетин (0,001%); фенолкарбоновых кислот - п-кумаровая (0,57%), кофейная (0,06%), салициловая (0,002%), хлорогеновая (0,02%), галловая (0,16%), феруловая (0,07%) кислоты; кумаринов - кумарин (0,08%), умбеллиферон (0,05%); органических кислот -лимонная (0,67%), яблочная (0,16%), янтарная (0,008%) кислоты.

Монозный состав после гидролиза водорастворимых полисахаридов был представлен глюкозой, галактозой, арабинозой, ксилозой, рамнозой, глюкуроновой кислотой; пектиновых веществ - галактозой, арабинозой, глюкуроновой и галакту-роновой кислотами.

На приборе «Аминохром II» было установлено, что сумма связанных аминокислот в траве посконника составляет в среднем 38,27 мг%, свободных - 11,00 мг%. Качественный состав аминокислот травы посконника отличается разнообразием: обнаружено 17 аминокислот, среди которых 4 являются незаменимыми (треонин, валин, лейцин, лизин).

В завершении изучения химического состава травы посконника конопляного с помощью спектрографа ДФС-8 определяли минеральный состав, который был представлен целым рядом макро- (натрий, калий, магний, кальций; 3,56%) и микроэлементов (железо, цинк, медь, кобальт, марганец; 0,15%).

Выявление действующих веществ травы посконника конопляного

Для нормирования качества травы посконника по основному показателю требовалось установление в ней веществ, проявляющих антимикробные свойства. Кроме того, выявление действующих веществ сырья позволяло ориентировать на них применяемый экстрагент, процесс извлечения, очистки и стандартизации в технологии экстракта. Наконец, антимикробные вещества посконника должны были стать доминирующим индикатором в исследованиях по разработке оптимального состава, технологии и нормированию качества получаемого на базе экстракта готового лекарственного средства.

На первом этапе решения задачи по выявлению действующих веществ изучалась антибактериальная (на 20 штаммах микроорганизмов) активность* экстрактов из травы посконника конопляного, полученных в равных условиях, но с использованием различных экстрагентов": воды, 40%, 70%, 95% спирта этилового, ацетона, хлороформа, гексана. Наиболее выраженная антибактериальная активность была присуща спиртовому экстракту (экстрагент - 95% этанол). В концентрации 8мг/мл он полностью подавлял рост всех исследованных штаммов, а при его содержании 4 мг/мл - стафилококков и бацилл. Существенно в меньшей степени активность проявляли ацетоновый и хлороформный экстракты из травы посконника. Гексановый и водно-спиртовые экстракты обладали антимикробным действием в максимально исследуемой концентрации (12 мг/мл) и избирательно по отношению к бациллам и стафилококкам соответственно.

Результат этого предварительного исследования позволил установить, что вещества - носители антимикробной активности посконника больше всего сосредотачиваются в экстракте, полученном с применением 95% спирта. Это свидетельствовало о наибольшей степени экстракционной селективности 95% спирта к содержащимся в сырье антимикробным веществам и оправдывало его использование в качестве экстрагента в последующих технологических исследованиях.

Для определения антимикробной группы веществ в составе высушенного до постоянной массы спиртового экстракта, его фракционировали посредством последовательной обработки разнополярными растворителями: хлороформом, этилацета-том и бутанолом с последующим высушиванием извлечений до постоянной массы. Затем осуществляли количественный анализ компонентного состава полученных фракций и высушенного «водного остатка», оставшегося после стадии бутанольной экстракции (таблица 2).

При исследовании химического состава (таблица 2) было обнаружено, что среди

* Выражаем искреннюю благодарность заведующему кафедрой микробиологии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава С.А. Бабичеву за предоставление базы для микробиологических исследований и консультативную помощь при интерпретации результатов.

Влияние использованных растворителей на микроорганизмы учитывалось в соответствующих контрольных опытах.

всех изученных объектов этил ацетатная фракция из спиртового экстракта отличалась значительным содержанием фенольных соединений: флавоноидов - 17,3%, фе-нолкарбоновых кислот - 64,3% и дубильных веществ - 3,5%.

Таблица 2 - Содержание основных БАВ в спиртовом экстракте травы поскон-ника конопляного и полученных из него фракциях_

Группа БАВ и индивидуальные вещества Содержание БАВ, (х ± Ах ), %

СЭ ХФ ЭФ БФ г ВО

Флавоноиды - хризин -рутин -кверцетин 3,74±0,07 0,29±0,009 1,36±0,05 0,38±0,011 - 17,3±0,35 0,12±0,004 0,41±0,012 0,06±0,002 12,4±0,25 0,03±0,0009 0,13±0,004 0,ОНО,0002 -

Фенолкарбоновые кислоты - салициловая - кофейная - хлорогеновая - п-кумаровая - галловая - феруловая 13,11±0Д6 0Д1±0,003 0,32±0,009 0,12±0,005 3,07±0,091 0,86±0,021 0,42±0,013 8,8±0,18 0,18±0,005 0,06±0,0015 0,31 ±0,008 3,42±0,102 0,12±0,004 0,36±0,010 643±1,28 5,15±0,154 3,12±0,093 32,42±0,92 12,02±0,32 8,13±0,24 9,9±0Д0 0,09±0,003 0,56±0,01б 4,12±0,12 0,39±0,001 -

Кумарины - кумарин - умбеллиферон 1,14±0,02 0,48±0,008 0,2б±0,009 1б,6±033 0,72±0,023 0,23±0,007 - - -

Органические кислоты - яблочная - янтарная - лимонная 11,87*0,25 0,95±0,028 0,09±0,003 2,5б±0,076 23±0,05 9,1±0,18 1,25±0,04 5,31±0,16 43±0,09 0,59±0,01б 0,57±0,017 23,7±0,57 4,1Ш,12 0,01±0,0002 7,07±0,21

Дубильные вещества 9,48±0Л1 3,5±0,07 4,4±0,09 5,4±0,11

Примечание: СЭ - высушенный стартовый экстракт; ХФ, ЭФ, БФ -высушенная хлороформная, этил ацетатная, бутанольная фракция, соответственно; ВО - высушенный «водный остаток».

Бутанольная фракция по сравнению с этилацетатной содержала примерно в 6

раз меньше фенолкарбоновых кислот и в 2 раза - флавоноидов и органических кислот. В «водном остатке» обнаруживались только органические кислоты (самая высокая концентрация в ряду сравниваемых объектов) и дубильные вещества, причем количество последних оказалось примерно сопоставимым с содержанием в этилацетатной и бутанольной фракциях. Хлороформная же фракция отличалась от всех остальных значительным содержанием кумаринов (16,6%) и отсутствием флавоноидов и дубильных веществ, а также уступала остальным фракциям по количеству фенолкарбоновых и органических кислот.

Все полученные фракции далее подвергали исследованию на антибактериальное действие методом реплик, результаты которого представлены в таблице 3.

\ 1

Таблица 3 - Антибактериальная активность спиртового экстракта из травы посконника конопляного н полученных из него фракций БАВ______

Тест-культу ЗЫ

Объект исследования 1-5 S tw S I 5 0 2; 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Спиртовый экстракт 12 10 8 4 ± + ± + ± + ± + + + + + + + + + + + + + ■ь + + +

Хлороформная фракция 12 10 8 + + + + + + + + + + + + + + + + -t-+ + + + ± -t + ± ± + ± ± + ± ± + ± ± + + + + + + + ± + + + + + + + + +

Этилацетатная фракция 12 10

4 2 + + + + + + + + + + ± + + + + + ± + ± + ± ± + + + + ± + + + +

Бутанольная фракция 12 10 + + + + + + + -t- + + + + + + + + + + + + + + + + + + ± + ± + ± + ± + ± + + + + +

«Водный остаток» 12 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

контроль: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Примечание: «+» - хороший рост; «+» - слабый рост; «-» - отсутствие роста 1. Escherichia coli MRE600; 2. Е. coli К-12 J53 1ас+; 3. Е. coli С -600 rif ' lac 4. Е. coli АТСС29212; 5. Protea mirabilis 3177; 6. Enterococcus faecalis (клинический изолят); 7. Enterococcus faecalis АТСС29212; 8. Staphylococcus aureus ATCC25923; 9. S. aureus (Макаров); 10. S. aureus 209P; 11. Micrococcus lutea; 12. S. epidermidis 1 (клинический изолят); 13. S. epidermidis 2 (клинический изолят); 14. Bacillus subtilis 6633; 15. В. subtilis L2; 16. В. mycoides 537; 17. В licheniformis; 18. В. cercus; 19. В. stearotermophylus; 20. Pseudomonas aeruginosa ATCC24853

Представленные в таблице 3 данные показывают, что в ряду сравниваемых

фракций наиболее выраженная антибактериальная активность присуща этилацетат-ной. В концентрации 8 мг/мл и выше она полностью угнетала рост всех исследуемых штаммов, а при её содержании 4 мг/мл - стафилококков и бацилл. Хлороформная фракция была активна лишь в отношении бацилл и в более высоких концентрациях (12 мг/мл). Все остальные фракции в изученных концентрациях оказались не активными.

На основе анализа и сопоставления данных по химическому составу всех фракций БАВ посконника (таблица 2) и изучению их антибактериальной активности был сделан вывод, что существенное антимикробное действие этилацетатной фракции обусловлено высоким содержанием в её составе группы фенолкарбоновых кислот.

Дальнейший корреляционный анализ химического состава и выраженности антимикробного эффекта подтвердил наличие зависимости между концентрацией фенолкарбоновых кислот в исследуемых фракциях и уровнем их бактерицидного действия. В частности, при уменьшении содержания этой группы БАВ наблюдалось соответствующее снижение степени антимикробной активности исследуемых фракций. Напротив, преобладание органических кислот в «водном остатке», а кумаринов - в хлороформной фракции, не вызывало превосходство их по степени активности над этилацетатной. Это свидетельствовало о второстепенной роли органических кислот и кумаринов в антимикробном действии посконника. Флавоноиды не могли быть рассмотрены как антимикробные вещества в посконнике, поскольку тогда активность бутанольной фракции была бы близка по уровню к этилацетатной. Что касается дубильных веществ, то признать за ними доминирующую роль в антимикробном действии также не было оснований, поскольку сопоставимое их содержание во фракциях предполагало бы примерно равноценную между ними активность.

Таким образом, на основании комплекса проведенных исследований был сделан вывод, что веществами травы посконника конопляного, обеспечивающими её антибактериальное действие, являются фенолкарбоиовые кислоты, содержащие в своем составе известные антимикробные вещества - п-кумаровую и галловую кислоты. При этом содержание п-кумаровой кислоты в ряду фенолкарбоновых кислот преобладало, что явилось основанием для её выбора в качестве вещества-стандарта в методике количественного определения фенолкарбоновых кислот.

Нормирование качества травы посконника конопляного Для нормирования качества травы посконника дополнительно к вышеприведенным исследованиям, проводили товароведческое и анатомо-морфологическое изучение сырья. В результате микроскопического исследования листа, стебля, цветка и плода были выявлены характерные диагностические признаки травы посконника, позволяющие идентифицировать это сырье. В частности, установлено, что эпидермис листа с обеих сторон характеризуется силыюизвилистыми тонкими стенками; устьице погруженные, окруженные 5-8 клетками (аномоцитный тип), с нижней стороны более многочисленные; верхняя и нижняя стороны листа покрыты 3-613

клеточными простыми волосками; над жилками и по краю листа волоски коленча-тоизогнутые; по обеим сторонам листа имеются также округлые железки с бесцветным, сильнопреломляющим в отраженном свете содержимым. На рисунке 1 представлены отдельные микрофотографии листа посконника конопляного.

Рисунок 1 - Лист посконника конопляного 1 - железка, 2 - простой волосок, 3 - жилка, 4 - коленчатоизогнутый волосок, 5 - устьица, 6 - клетки эпидермиса

Совокупность фармакогностических и микробиологических исследований позволила предложить показатели и нормы качества травы посконника (таблица 4).

Таблица 4 - Основные показатели и нормы качества травы посконника

Показатели Нормы

Подлинность УФ-спектр поглощения спиртового извлечения в интервале длин волн от 300 нм до 350 нм должен иметь один максимум при длине волны 325±2 нм. На хроматограмме (ТСХ) спиртового извлечения в УФ-свете на уровне зоны адсорбции PCO ti-кумаровой кислоты должно появиться пятно темно-фиолетового цвета с Rf 0,39.

Содержание фенолкарбоновых кислот Не менее 2%

Экстрактивные вещества, извлекаемые 95% спиртом Не менее 16%

Влажность Не более 12%

Золы общей Не более 8%

Золы, не растворимой в 10% кислоте хлористоводородной Не более 1%

Органической примеси Не более 1%

Минеральной примеси Не более 1%

Микробиологическая чистота Категория 4Б

Разработка технологии и нормирование качества сухого экстракта травы посконника конопляного

Учитывая то, что в технологии сухих экстрактов одной из основных стадий

является экстрагирование сырья, следующим этапом исследований было получение

спиртового извлечения из травы посконника вакуум-фильтрационным (ВФЭ) способом экстрагирования. Выбор ВФЭ был обусловлен его более высокой эффективностью и наличием ряда преимуществ технологического характера над реперколяци-онными и другими широко распространенными способами экстрагирования, а также необходимостью использования 95% спирта.

Выбранный способ ВФЭ травы посконника конопляного требовал применения отличного от общепринятого способа подготовки сырья, который бы обеспечивал максимальное вскрытие растительных клеток и образование развитой поверхности раздела фаз в системе «твердое тело - жидкость». Добиться этого позволило двух-трехкратное вальцевание, в результате чего были достигнуты необходимые технологические свойства травы посконника, в частности, по количеству частиц, показателю удельной поверхности материла, суммарной поверхности частиц, сыпучести и порозности сырья.

Далее для процесса ВФЭ травы посконника были выбраны оптимальные условия его проведения и изучен переход суммы БАВ и групп действующих веществ в 95% спиртовое извлечение. Для этого с одной загрузки сырья массой 100,0 г последовательно получали пять отдельных сливов по 100 мл (1:1), в каждом из которых определяли «сухой остаток» и содержание фенолкарбоновых кислот (таблица 5).

Таблица 5 - Содержание суммы БАВ («сухого остатка») и группы фенолкарбоновых кислот в сливах, полученных способом ВФЭ травы посконника

лива

«Сухой остаток» извлечения, %

Эффективность экстракции по сумме БАВ, %

Содержание фенолкарбоновых кислот, %

Эффективность экстракции по фенолкарбоновым кислотам,%

1

7,91

47,08

1,01

46,76

3,38

20,12

0,65

30,10

2,54

15,12

0,28

12,96

1,22

7,26

0,09

4,17

0,74

4,40

0,04

1,85

римечание - Приведены средние значения пяти определений для сырья, содержащего 16,8% экс. активных веществ и 2,16% суммы фенолкарбоновых кислот_

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что достаточно полное истощение

травы посконника конопляного наблюдается при получении пяти сливов. Суммарная эффективность извлечения всех спиртоэкстрагируемых БАВ из травы посконника при этом достигает 94%, фенолкарбоновых кислот - 96%.

Для очистки спиртового извлечения от хлорофиллов и других липофильны веществ с целью повышения концентрации фенолкарбоновых кислот, улучшени технологических свойств и потребительских качеств получаемого в итоге экстракта использовали прием частичного концентрирования (до 1/3 от первоначального объ ема), выдерживания в прохладном месте с последующим отделением фильтрацией выпавшего осадка. Для получения сухого экстракта фильтрат концентрировали и высушивали в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60°С. В результате исследований была предложена технологическая схема производства сухого экстракта травы посконника конопляного (СЭТПК), которая представлена на рисунке 2.

ВР.2.1

ВР.1.1 Санитарная подготовка помещения и оборудования <- ВР. I Кт.Км, Кх Санитарная подготовка производства и персонала

ВР.1.2 Санитарная подготовка персонала

Измельчение и просеивание сырья

ВР.2.2 Отмеривание 95% спирта этилового

ВР2.3 Подготовка упаковочного и маркировочного материала

ТП.З 1 Экстрагирование сырья 95% этанолом

ТП.3.2 Концентрирование, отстаивание, фильтрация, сгущение извлечения

ТП.3.3 Сушка, измельчение, просеивание экстракта

ТП.З.4 Регенерация спирта этилового

УМО. 4.1 Фасовка и маркировка экстракта

УМО. 4.2 Размещение банок с экстрактом в групповую тару и маркировка

ВР. 2 Кт, Кх Подготовка сырья и вспомогательного материала

ТП.З Кт, Кх Получение сухого экстракта из травы посконника конопляного

1

УМО. 4 Кт, Кх, Км Упаковка, маркировка сухого экстракта травы посконника конопляного

На склад готовой продукции

Измельченное сырье и 95% спирт на ТП.З I

Потери

Готовый продукт

Карантинное

хранение

Рисунок 2 - Технологическая схема производства сухого экстракта травы посконника конопляного

16

Для исследования фотохимического состава и нормирования качества из различных образцов травы иосконника было наработано пять серий СЭТПК по предложенной технологии. Среднее содержание в нём флавоноидов составило 4,34%, фенолкарбоновых кислот - 15,10%, кумаринов - 1,47%, органических кислот -13,0%, дубильных веществ - 11,01%.

Сравнивая эти данные с содержанием основных спиртоэкстрагируемых групп БАВ в траве посконника (таблица 1), можно заключить, что группа фенолкарбоновых кислот в структуре химического состава сухого экстракта по количественному содержанию «перераспределилась» на первое место. Это свидетельствовало о рациональности и целенаправленной ориентированности на действующие вещества разработанной технологии.

Основываясь на требованиях ОСТ 91500.05.001 были определены нормируемые показатели СЭТПК, в том числе содержание фенолкарбоновых кислот (не менее 14%).

Разработка состава и технологии мази с сухим экстрактом травы посконника конопляного

В качестве носителей для мазей СЭТПК были изучены широко применяемые в

производстве основы, обеспечивающие хорошее распределение разнополярных веществ, легкое нанесение на кожу и удаление. СЭТПК вводили в мазь в количестве 2% с учетом выявленной для него степени антимикробной активности. Составы мазевых композиций приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Составы 2% мазей сухого экстракта травы посконника

Компонент Мазь №

1 2 3 4 5 6 7 8

СЭТПК 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2.0 2,0

ПЭО 400 58,8 78,4 40,0

Г1ЭО 1500 39,2 19,6

Карбопол 2,0 2,0

пвс 15,0

Триэтаноламин 2,0 2,0

Глицерин 5,0 10,0 10,0

Ыа-КМЦ 6,0

Вазелин 60,0

Эмульгатор Т'з 10,0

Эсилон-5 82,32

Аэросил 15,68

Вода очищенная Г до 100,0 до 100,0 до 100,0 до 100,0 до 100,0

Одной из важных характеристик любой лекарственной формы является вы-свобождаемость включенных в нее БАВ. В этой связи определяли степень и скорость высвобождения (фармацевтическую доступность) фенольных соединений из мазей СЭТПК, для чего использовали известный метод диффузии в агаровый гель. Для нахождения величины зоны диффузии (D) фенольных соединений, в агар вводили 10% раствор железа хлорида (Ш). В результате было установлено, что наибольшую степень высвобождения фенольных соединений, в том числе фенолкарбо-новых кислот, обеспечивает мазевая композиция состава №3, а близкими к ней биофармацевтическими характеристиками обладали мази №1,2 и 4 (рисунок 3).

D, мм »i_тш —_ . r '.J4';.;.'

" I IИ И л л ш л "

»> i и и i ■ 11 и .....

... -1 ■■■■■■■

мазевой

12345678

КОМПОЗИЦИИ -

■i Рисунок 3 - Диаграмма степени высвобождения фенольных соединений из мазей сухого экстракта травы посконника конопляного

Для выявления оптимального состава в ряду мазевых композиций №1-4 их исследовали на противомикробную активность в условиях in vitro методом лунок (таблица 7).

Таблица 7- Антимикробная активность мазей сухого экстракта травы посконника конопляного

Исследуемый объект Тест-культуры

1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 10 1 11 1 12 1 13 1 14 1 15 I 16

Диаметр зон задержки роста микроорганизмов, мм

Мазь№1 11 12 10 18 18 20 13 10 10 10 12 10 10 11 15 12

Мазь №2 И 12 10 17 19 20 14 10 10 10 12 10 10 10 13 11

Мазь №3 14 15 10 25 27 26 15 11 12 12 13 10 10 14 18 19

Мазь №4 12 13 10 20 23 24 15 10 10 10 11 10 10 11 16 15

Мазь «Календула» - - - 12 14 12 10 10 - 10

Примечание - 1. Escherichia coli MRE600; 2. Е. coli АТСС29212; 3. Enterococcus faecalis ATCC29212; 4. Staphylococcus aureus ATCC25923 ; 5. S. aureus (Макаров); 6. S. aureus 209P; 7. S. epidermidis 1 (клинический изолят); 8. Micrococcus lutea; 9. Bacillus subtilis 6633; 10. В. subtilis L2; 11. В. mycoides 537; 12. В. licheniformis; 13. В. cereus; 14. В. stearotermophylus; 15. Proteus mirabilis; 16. Pseudomonas aeruginosa ATCC24853; «-» - отсутствие зоны задержки роста тест-культуры.

Как видно из данных таблицы 7, все мази СЭТПК обладали антимикробной ктивностью, особенно по отношению к грамположительным микроорганизмам. Бо-ее того, мазь состава №3 оказывала выраженное противомикробное действие даже а такие бактерии, как Ps. aeruginosa и Proteus, обладающие множественной анти-иотшсорезистентностью. Было установлено также, что антибактериальное действие сследуемых образцов мазей в отношении грамотрицательных микроорганизмов начительно превосходило аналогичную активность мази «Календула».

Далее определяли реологические параметры мази с оптимальным составом °3, для чего использовали ротационный вискозиметр «Реотест-2» типа RV (Герма-ия) с цилиндрическим устройством. Полученная кривая кинетики деформации мази в бласти изменения градиента скорости от малых величин к большим и наоборот позывает, что течение её начинается не мгновенно, а после некоторого приложения наряжения, необходимого для разрыва элементов структуры (рисунок 4).

Скорость сдвига, с"'

10 11 12 13 14 IS

Касательное напряжение, н/и2

Рисунок 4 - Реограмма течения мази сухого экстракта травы посконника состава №3

Касательное напряжение возрастает с увеличением скорости деформации до оп-

. деленных величин. В период вновь убывающего напряжения вязкость системы практически восстанавливается, что подтверждает наличие пластично-вязко-тиксотропных свойств мази. Нисходящая вместе с восходящей кривой образуют «петлю гистерези-

са», что подтверждает тиксотропносгь исследуемой системы и характеризует хорошую намазываемость и экструзию из туб мази.

Таким образом, на основании всех проведенных исследований была выбрана мазевая композиция следующего состава: СЭТПК - 2,0; карбопол - 2,0; триэтанола-мин - 2,0; глицерин - 5,0; вода очищенная - до 100,0.

С учетом свойств компонентов предложенной мази СЭТПК, для неё была разработана оптимальная технология и предложена соответствующая схема производства (рисунок 5).

Рисунок 5 - Технологическая схема производства 2% мази сухого экстракта травы посконника конопляного

Оценка качества мази, наработанной в лабораторных условиях, проводилась

по предусмотренным ОСТ 91500.05.001 показателям, включая содержание фенол-карбоновых кислот (таблица 8). В качестве упаковки мази СЭТПК использовались алюминиевые тубы с внутренним лаковым покрытием вместимостью 50,0 г.

Таблица 8 — Основные показатели и нормы качества мази сухого экстракта травы посконника конопляного_

Показатели Нормы качества

Описание Однородная желто-зеленая масса вязкой гелеобразной консистенции

Подлинность На хроматограмме (ТСХ) спиртового извлечения в УФ-свете на уровне зоны адсорбции PCO n-кумаровой кислоты должно появиться пятно темно-фиолетового цвета с Rf 0,39.

Масса содержимого упаковки, г 50±2

рН водного извлечения 4,5-6,0

Содержание фенолкарбоновых кислот Не менее 0,28%

Микробиологическая чистота Категория ЗБ

Изучение стабильности мази СЭТПК в процессе хранения осуществляли в алюминиевых тубах в холодильнике при температуре +10°С. Результаты этого исследования показали стабильность мази при хранении в течение срока наблюдения -18 месяцев.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено фитохимическое исследование травы посконника конопляного как потенциального источника антимикробных БАВ. Установлено, что в траве посконника содержатся флавоноиды (в среднем 0,64%), фенолкарбоновые кислоты (2,19%), кумарины (0,21%), дубильные вещества (6,12%), органические кислоты (3,61%), аминокислоты связанные и свободные (11,0 мг% и 38,27 мг% соответственно), водорастворимые полисахариды (4,84%), пектиновые вещества (3,85%).

2. Сравнительные исследования химического состава и уровня антибактериальной активности фракций, полученных с использованием различных по полярности экстрагентов и отличающихся составом БАВ, позволили отнести фенолкарбоновые кислоты к группе соединений, определяющей антимикробное действие травы посконника.

3. Разработана методика количественной оценки содержания фенолкарбоновых кислот в траве посконника, сочетающая прямую и дифференциальную спектрофото-метрию. Валидационный анализ методики по «специфичности», «линейности», «точности», «воспроизводимости» и «достоверности» показал отсутствие систематической ошибки и подтвердил возможность ее использования для количественного определения фенолкарбоновых кислот.

4. Предложены показатели и нормы качества травы посконника на основе результа тов фитохимического, микробиологического, товароведческого и морфолого анатомического исследования сырья, из которых в числе основных - содержали фенолкарбоновых кислот - не менее 2%, суммы спиртоэкстрагируемых веществ не менее 16%.

5. Выявлено, что наилучшей экстрагирующей способностью по отношению к фенол карбоновым кислотам травы посконника обладает 95% этиловый спирт. С учето этого разработана технология сухого экстракта, предусматривающая вакуум фильтрационное экстрагирование (1:5) измельченного вальцеванием сырья, очист ку от сопутствующих липофильных веществ и концентрирование в щадящих тем пературных условиях получаемого извлечения.

6. Исследование БАВ, содержащихся в сухом экстракте травы посконника, показал количественное преобладание фенолкарбоновых кислот от суммы всех спиртоэкс трагируемых соединений в исходном сырье, что подтверждает рациональност предложенной технологии.

7. Проведено нормирование качества разработанного сухого экстракта травы по сконника конопляного, в том числе по содержанию фенолкарбоновых кислот (н менее 14%) и влаги (не более 5%), предложена упаковка, определены условия срок его хранения (2 года).

8. Комплекс проведенных биофармацевтических, реологических, микробиологиче ских и других исследований позволил определить оптимальный состав мази сухо го экстракта травы посконника: основного компонента - 2,0; карбопола - 2,0; три этаноламина - 2,0; глицерина - 5,0; воды очищенной - до 100,0. Предложена учетом компонентного состава рациональная технология мази и установлена е" стабильность в течение 18 месяцев хранения в холодильнике при температур +10°С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение возможности использования травы посконника конопляного для разработки антимикробного средства // Медицинская наука и здравоохранение: науч.-практ. конф. молодых ученых и студ. юга России (3, 2005, Краснодар): материалы...- Краснодар, 2005.-С.222-224 (соавт.: Хочава М.Р., Сампиев A.M.).

2. Исследования антимикробной активности посконника конопляного травы // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2005. - Вып. 60. - С.418-420. (соавт.: Бабичев С.А., Хочава М.Р., Сампиев А.М.).

3. Сравнительное исследование антибактериальной активности экстрактов травы посконника конопляного // Кубанский науч. мед. вестн. - 2006. - №1-2 (82-83).-С.86-87 (соавт.: Бабичев С.А., Сампиев А.М.).

4. Некоторые концептуальные подходы к оптимизации производства и использования растительного сырья на фармацевтических фабриках // Акту алый питания фармацевтичжн та медично{ науки та практики: 3ÖipHHK наукових статей. -Запор1жжя: видавництово ЗДМУ, 2006. - Випуск XV, Том 2.- С.391-394 (соавт.: Сампиев A.M., Хочава М.Р., Никифорова Е.Б., Давитавян H.A., Дзаурова М.М., Сергеев Н.С.).

5. Особенности извлечения фенольных соединений в условиях вакуум-фильтрационного экстрагирования травы посконника // Медицинская наука и здравоохранение: науч.-практ. конф. молодых ученых и студ. юга России (5, 2006, Краснодар): материалы... - Краснодар, 2006,- С.266-268 (соавт.: Сампиев А.М., Хочава М.Р.).

6. Исследование полисахаридов травы посконника конопляного // Научное обозрение.- 2006. - №2,- С.39-42 (соавт.: Сампиев A.M.).

7. Растения - примеси: посконник конопляный // Врач и Аптека XXI века.- 2006. -№3. -С.26-28. (соавт.: Сампиев A.M., Хочава М.Р.).

8. Микроскопический анализ травы посконника конопляного // Кубанский науч. мед. вестн.- 2006.- №12 (93). -С.98-101 (соавт.: Сампиев А.М.).

9. Аминокислотный и минеральный состав травы посконника конопляного // Изв. вузов. Сев.-Кав. регион. Естеств. науки.- 2007. - №4 (140). - С.92-93. (соавт.: Сампиев А.М.).

10. Исследование органических кислот травы посконника конопляного // Естествознание и гуманизм: сб. науч. тр. - Томск, 2007. - Том 4, №3. - С.68. (соавт.: Сампиев A.M.).

11. Изучение антимикробных свойств мазей с сухим экстрактом травы посконника конопляного // Человек и лекарство. Краснодар - 2008: тез. докл. конгр. 16-18 окт. 2008 г. - Краснодар, 2008. - С. 112. (соавт.: Сампиев A.M., Бабичев С.А.)

ШЕВЧЕНКО АНАСТАСИЯ ИГОРЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ ИЗ ТРАВЫ ПОСКОННИКА КОНОПЛЯНОГО

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Подписано в печать 29.10.2008 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1357 Отпечатано ООО «Фирма ТАМЗИ», г. Краснодар, ул. Пашковекая, 79 Тел. 255-97-48