Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий

Автореферат отсутствует в библиотеке
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертация отсутствует в библиотеке
ДИССЕРТАЦИЯ
Сорокина, Юлия Васильевна Пермь 2009 г.
Ученая степень
кандидат фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.01
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий

На правах рукописи

СОРОКИНА ЮЛИЯ ВАСИЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь-2009

003470596

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, директор по НИР ЗАО «Медисорб»

кандидат фармацевтических наук, доцент ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Молохова Елена Игоревна Несчисляев Валерий Александрович

Вдовина Галина Петровна Чиркова Маргарита Александровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»

Защита состоится «15» июня 2009 в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01. при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ГСП-277, ул. Ленина, 48, e-mail: perm@pfa.ru. факс: 2-12-94-76

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Пермской государственной фармацевтической академии (http:www.pgfa.ru) «15» мая 2009 г.

Автореферат разослан «14» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент (^р^ ИА. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительная роль дисбиозов в патогенезе большого количества заболеваний является причиной востребованности пробиотиков в медицинской практике. В настоящее время перспективным направлением в сфере разработки этих лекарственных средств является создание поликомпонентных препаратов и пробиотиков метаболитного типа. Механизм действия последних основан на регулировании симбионтных отношений организма человека и его микробиоценоза за счет компенсации дефицита метаболитов и создания благоприятных условий для развития собственной микрофлоры. Про-биотики метаболитного типа представляют собой препараты заместительной терапии и практически не оказывают побочных действий (Грачева Н.М., 2007). На отечественном фармацевтическом рынке доминирует один из представителей этой группы - «Хилак -форте» («Меркле ГмбХ»), содержащий в своем составе продукты метаболизма кишечной палочки, лактобактернй, кишечного стрептококка, а также ряд других дополнительно введенных компонентов, в том числе синтетическую молочную кислоту. Производство российских аналогов «Хилак - форте» при наличии перспективных разработок до настоящего времени не организовано.

В НИИ экспериментальной медицины (г. Санкт-Петербург) получены суперна-танты, содержащие метаболиты пробиотических культур Enterococcus faccium, и изучена их антагонистическая активность (Ермоленко Е.И. с соавт., 2007). Разработана технология препарата «Актофлор», представляющего собой низкомолекулярную фракцию культу-ральной жидкости штамма Escherichia coli М-17 (Вахитов Т.Я. с соавт., 2005). На основе гидролизатов молочнокислых бактерий вида L. acidophilus получен БАД «Биолактон» (Сенченко С.П., 2006).

В Пермском НПО «Биомед» разработан способ получения метаболитного препарата «Микростим» с использованием штамма-продуцента Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ (Не-счисляев В.А., Чистохина Л.П., 2004). В ходе исследований выявлено пробиотическое и антимикробное действие метаболитного комплекса, а также его иммуномодулирующая активность при пероральном и интравагинальном применении. Препарат «Микростим» рекомендован для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, а также гнойно-септических осложнений в акушерско-гинекологической практике. Представляется актуальным более глубокое изучение состава и создание широкого спектра лекарственных форм данного метаболитного препарата на основе ультрафильтрата культуральной жидкости лактобактерий (УКЖЛ). Особый интерес вызывает создание мягких лекарственных форм (МЛФ) пробиотика, в том числе для профилактики и терапии гинекологических заболеваний.

Цель настоящего исследования - разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм (вагинальных суппозиториев и мази защитного действия) про-биотического препарата на основе метаболитов лактобактерий штамма-продуцента L. plantarum SP-A3.

Осповные задачи исследования:

1. Получить экспериментальные серии УКЖЛ штамма L. plantarum 8Р-АЗ, подобрать оптимальные условия и отработать способ его подготовки (концентрирование) для введения в лекарственные формы.

2. Провести сравнительное изучение физико-химических и биологических характеристик иативного (исходного) и концентрированного УКЖЛ.

3. Разработать состав и технологию суппозиториев вагинальных и мази защитного действия на основе концентрированного УКЖЛ.

4. Оценить качество полученных лекарственных форм метаболитного препарата и провести стандартизацию суппозиториев вагинальных с концентрированным УКЖЛ.

Научная новизна работы. Предложен способ подготовки исходного субстрата для получения лекарственных форм метаболитного препарата. Определены оптимальные параметры концентрирования нативного УКЖЛ на вакуум-выпарной установке, позволяющие значительно улучшить технологические свойства и сохранить биологическую активность.

Изучен качественный и количественный состав исходного и концентрированного УКЖЛ. Показано, что все действующие вещества сохраняются при концентрировании и их количество увеличивается пропорционально степени сгущения. У концентрированного УКЖЛ установлена пробиотическая, противомикробпая активность, а также определено его влияние на чувствительность L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 к ряду антибиотиков.

С помощью метода математического планирования, а также реологических исследований выбраны оптимальный состав и технология вагинальных суппозиториев. Показана возможность определения противомикробной активности МЛФ метаболитного препарата микрометодом серийных разведений.

Практическая значимость. Разработана рациональная технология МЛФ препарата на основе УКЖЛ, что позволяет расширить номенклатуру и повысить потребительские свойства метаболитных пробиотиков.

Составлено изменение (накопительная ведомость изменений № 24 от 18 декабря 2008 г.) к промышленному регламенту на производство лактобактерина сухого (регистрационный номер ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 1567-04), включающее концентрирование

бактериальной взвеси лакгобактерий методом ультрафильтрации для получения клеточной взвеси и бесклеточной культуральной жидкости (УЮКЛ).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО ПГФА кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии (акт внедрения от 18 апреля 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения, состав и свойства концентрата УЮКЛ.

2. Состав и технология суппозиториев и мази на основе метаболитного комплекса лакто-бактерий.

3. Обоснование показателей стандартизации и оценка качества полученных МЛФ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств, посвященной 85-летию со дня рождения A.C. Саратикова» (Томск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вак-цинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на четвертом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); Международном конгрессе «Пробиотики, прсбиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященной 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» (Пермь, 2008).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ», раздел «Фармация» (№ Гос. регистрации 01.9.50 007426).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 статья в зкурнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 30 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, двух глав экспериментальных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 147 источников, из них - 27 зарубежных авторов, приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении представлены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен обзор литературы, включающий сведения о биологических свойствах и функциях лактобактерий, их метаболитов, а также результаты технологических разработок препаратов на их основе.

Объекты н методы исследования (Глава 2)

В работе применяли УКЖЛ, полученный из бактериальной взвеси лактобактерий методом ультрафильтрации на установке УПЛ-0,6 (Россия) с использованием половоло-конных (ВПУ-15) разделительных аппаратов. Для микробиологических исследований использовали коллекционные штаммы микроорганизмов (Lactobacillus acidophilus КЗШ24, Escherichia coli M-17, Candida albicans ATCC 885-653, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus ATCC 65-38-P, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) и культуры, выделенные из клинического материала (биотоп - гинекологический тракт): Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella.

Для культивирования клеток применяли питательные среды: МРС-1; МРС-2; МРС-4; МРС-5; мясо-пептонный агар; мясо-пептонный бульон; 0,5% раствор глюкозы; среда №199 (филиал ФГУП НПО «Микроген» МЗРФ «Пермское НПО «Биомед»).

В качестве вспомогательных использовали вещества, разрешенные к применению в фармацевтической промышленности и отвечающие требованиям нормативной документации.

Определение плотности нативного и концентрированного УКЖЛ проводили с использованием ареометра (ГФ XI, вып. 1). Кислотность исходного и концентрированного УКЖЛ изучали титриметрическим методом (ФСП 42-05047298054 «Лактобактерин сухой»). Спектры поглощения исследовали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) в диапазоне длин волн 240-350 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количественное определение низкомолекулярных пептидов в нативном и концентрированном УКЖЛ проводили по методу Лоури и с применением биуретового реактива; содержание общего азота - с реактивом Несслера (ФС 42-3874-99). Органические кислоты определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системах: этилацетат - муравьиная кислота - вода очищенная (3:1:1); н-бутанол - муравьиная кислота - вода очищенная (30:5:10); н-пропанол - концентрированный раствор аммиака (6:4) и с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза в системе Agilent, аминокислотный состав - методом бумажной хроматографии в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода очищенная (4:1:2) и на аминокислотном анализаторе Биогроник 1С - 2000 (Германия).

Определение противомикробной активности концентрированного УКЖЛ и суппо-зиторного извлечения проводили по микрометоду серийных разведений (Аверьянова Н.И. с соавт., 2007). Влияние концентрата УКЖЛ, при его добавлении в питательную среду, на антагонистическую активность лактобактерий и антибиотикочувствительность штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 оценивали соответственно регламентированным методом отсроченного антагонизма (ФСП 42-05047298054) и дискодиффузионным методом согласно методическим указаниям (Москва, 1983). Определение специфической (пробио-тической) активности метаболитного комплекса включало исследование кислотообразо-вания и динамики роста культуры лактобактерий при внесешш концентрированного УКЖЛ в питательный субстрат (0,5% раствор глюкозы) (Чистохина Л.П., 2004).

Термостабильность, рН, тип эмульсий модельных суппозиторных композиций исследовали по ГОСТ Р 52343-2005. Изучение скорости высвобождения молочной кислоты из суппозиторных масс в питательную среду проводили методом диффузии в агаровый гель (МолоховаЕ.И., 2003). Структурно-механические свойства суппозиториев изучали на ротационном вискозиметре «Реотест-2.1» (Германия) с использованием устройства конус плиты при различных температурных режимах.

Защитные свойства мази определяли путем проведения диализа через полупроницаемую мембрану с последующим титрованием диализата 0,1 M раствором кислоты хлористоводородной (Молохова Е.И., 2003).

Полученные результаты обработаны методами математической статистики с использованием программы «Microsoft Excel».

Получение и сравнительное изучение свойств иативного и концентрированного ультрафнльтратов культуральнон жидкости лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ (Глава 3)

В работе по созданию МЛФ наработаны 5 серий нативного УКЖЛ. Для получения концентрата его сгущали в 10 раз на вакуум-выпарной установке с последующей стерилизацией в паровом стерилизаторе при температуре 110 °С в течение 30 минут. В ходе концентрирования подобраны условия для получения оптимального по технологическим свойствам продукта: температура - 90 "С, давление (разрежение) - 0,04-0,05 МПА, объем однократной порции в концентрирующей колбе - 200 мл. По окончании процесса получали более вязкую жидкость с характерными органолептическими показателями. Серии нативного и концентрированного УКЖЛ характеризовали по физико-химическим показателям: внешний вид, рН, плотность и кислотность, которые представлены в табл.1.

9шв»-шапмпн параметры впгап в пвцппрфнвшшп УКЙСЛ

Нативный УЮКЛ Концентрирован

№ серии Внешний вид РН Плотность, г/мл Кислотность, °Т № серии Внешний вид рН

1 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,65 ±0,10 1,014 ±0,005 31,00 ±1,50 к 1 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,60 ±0,1 С

2 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,50 ±0,10 1,016 ±0,003 40,00 ±0,70 к 2 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,1 С

3 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20 1,016 ±0,005 37,00 ±1,30 кЗ Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20

4 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 6,72 ±0,10 1,014 ±0,002 38,00 ±1,20 к 4 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 6,50 ±0,10

5 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,43 ±0,20 1,016 ±0,005 46,00 ±0,90 к 5 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20

Установлено, что при концентрировании нативного УКЖЛ кислотность возрастает в пределах от 15 до 19 раз. Количественные показатели плотности увеличиваются при этом в 1,1- 1,2 раза. Во всех сериях показатели рН остались неизменными, что свидетельствует о сохранении в ходе концентрирования буферных свойств нативного УКЖЛ.

УФ-спектры концентрата УКЖЛ имеют максимум поглощения при длине волны 245,7 нм и минимум поглощения при длине волны 266,1 нм, что идентично УФ-спектрам исходного УКЖЛ.

Для нативного и концентрированного УКЖЛ определено содержание общего азота, а также белков (низкомолекулярных пептидов). Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Сравнительная характеристика исходного и концентрированного УКЖЛ

по количеству азотсодержащих соединений

Исследуемый объект Общий азот, мг/мл Белок (метод Лоури), мг/мл Белок (с биуретовым реактивом), мг/мл

Нативный УКЖЛ 8,06±1,50 6,40±1,20 6,59±1,30

Концентрированный УКЖЛ 91,05±1,90 50,97±2,50 63,04±3,10

Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание общего азота при концентрировании увеличивается в 11,3 раза, белка по методу Лоури - в 8 раз и по методу с использованием биуретового реактива в - 9,6 раз. Таким образом, процесс сгущения су-ществено и пропорционально повышает количество азотсодержащих соединений в концентрированном УКЖЛ.

В качестве методов, позволяющих определить подлинность органических кислот в УКЖЛ, апробированы ТСХ и потенциометрическое титрование. Методом ТСХ обнаружена молочная кислота - один из основных метаболитов лакгобактерий. Установлено, что наиболее подходящей является система этилацетат - муравьиная кислота - вода очищенная (3:1:1). По результатам потенциометрического титрования построены дифференциальные и интегральные кривые, которые идентичны для нативного и концентрированного УКЖЛ, а также для водного извлечения из суппозиториев, что позволяет использовать их для подтверждения подлинности препарата (наличие концентрата УКЖЛ в МЛФ).

С целью количественного определения органических кислот получены электрофо-реграммы концентрированного и нативного УКЖЛ (рис. 1-2).

Рис. 1. Электрофореграмма концентрированного УКЖЛ, разведенного в 1000 раз

1 - пик уксусной кислоты

2 - пик молочной кислоты

г"|1п |п1о(гл«Коп к Тим Аг а Не1яМ М/И1Ь Лгв«Х ЗупиюЬу

СЕ По ! П 1 ) 17.4 О.ОЯОЭ | 8173 I 09« )

По Р<*Ь C:\HPCHEM\I \DATA\08 04 ЗСЧ Ьгх 5 «03 <! .1 | 83.5

ВЫ« ЭмвЫШо ЗОЛЫМ. 160017

Рис. 2. Электрофореграмма нативного УКЖЛ, разведенного в 100 раз

1 - пик уксусной кислоты

2 - пик молочной кислоты

С помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза в УКЖЛ были обнаружены молочная и уксусная кислоты при отсутствии пропионовой, масляной и янтарной кислоты. Из данных, представленных в табл. 3, видно, что количество органических кислот пропорционально увеличивается при концентрировании УКЖЛ, при этом содержание молочной кислоты возрастает в 11,4 раза, а содержание уксусной кислоты - в 8,3 раза.

Таблица 3

Состав и количество органических кислот в исследуемых объектах

Анализируемый образец Содержание молочной кислоты, мг/мл Содержание уксусной кислоты, мг/мл Соотношение кислот

Нативный УКЖЛ 46,89±0,10 2,68±0,10 4,7 :0,26

Концентрат УКЖЛ 532,82±0,20 22,12±0,20 5,3 : 0,22

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при сгущении нативного УКЖЛ спектр органических кислот остается постоянным, а их количественное содержание увеличивается.

В ходе исследования аминокислотного состава нативного и концентрированного УКЖЛ методом бумажной хроматографии обнаружено и идентифицировано (путем сопоставления значений КГ пятен исследуемого образца и стандартных аминокислот) 10 аминокислот. Схема хроматограммы представлена на рис. 3.

0,9 0,8 0.7 0,6 2 0,5 0.4 0,3 0,2 0,1 о

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 3. Аминокислотный состав нативного и концентрированного УКЖЛ

Примечание: 1-р-аланин; 2 - лейцин; 3 - цистин; 4 - глицин; 5 -Ь-изолейцин; 6 -тирозин; 7 - Ь-аспарагин гидрохлорид; 8 - 0,Ь-орнитин; 9 - 0,Ь-серин; 10 — Ь— глутаминовая кислота; 11 - 0,Ь~лизин моногидрохлорид; 12 - Ь-метионин; 13 - Ь-глутамин; 14 - Ь-гистидин гидрохлорид; 15 - валин; 16 - пролин; 17 - нативный УКЖЛ; 18 - концентрированный УКЖЛ, разведенный водой очищенной в 10 раз.

Для расширения сведений об аминокислотном составе нативного и концентрированного УКЖЛ проведены исследования на аминокислотном анализаторе. В ходе анализа обнаружен широкий спектр аминокислот: аспарагиновая, треонин, серин, глутаминовая, пролин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, ли-

зин, гистидин, аргинин (16 аминокислот) и определено их количество в свободном и связанном состоянии.

Микробиологическими исследованиями установлена пробиотическая активность концентрата, его стимулирующее влияние на рост штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K3I1124 (наблюдали прирост оптической плотности бактериальной взвеси). Данные представлены в табл. 4.

Таблица 4

Стимулирующее влияние концентрированного УКЖЛ на рост различных

штаммов лактобактерий

Исследуемые штаммы Величина прироста оптической плотности через 24-48 ч, D540 Коэффициент стимуляции роста

Контроль Добавление в питательную среду концентрата УКЖЛ

L. plantarum 8Р-АЗ 0,140±0,010 0,370±0,01* 2,57

L. acidophilus КЗШ24 0,011+0,003 0,079+0,012* 7,00

Примечание. * -j9<0,001 по /-критерию Стыодента в сравнении с контролем.

Концентрат УОШ стимулировал рост лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ, увеличивая оптическую мутность культуры в 2,57 раза, a L. acidophilus КЗШ24 - в 7 раз. Для определения метаболитного воздействия на биохимические свойства лактобактерий оценивали влияние концентрата на активность кислотообразования L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus КЗШ24.

Таблица 5

Стимулирующее влияние концентрированного УКЖЛ на активность

кислотообразования различных штаммов лактобактерий

Исследуемые штаммы Величина прироста общей кислотности через 24-48 ч, °Т Коэффициент стимуляции кислотообразования

Контроль Добавление в питательную среду концентрата УКЖЛ

L. plantarum 8Р-АЗ 26,11+2,12 34,22±0,59* 1,31

L. acidophilus K3IU24 2,25±0,75 17,63±1,95** 7,83

Примечание. * - /КО,01; ** - /?<0,001 по /-критерию Стыодента в сравнении с контролем.

Установлено, что активность кислотообразования усилилась у L. plantarum 8Р-АЗ в 1,31 раз, а у L. acidophilus КЗШ24 - в 7,83 раза (табл. 5).

Для концентрированного УКЖЛ определена противомикробная активность в отношении музейных и клинических штаммов микроорганизмов. Параметры МПК (мини-

мальная подавляющая концентрация) включены в табл. 6.

Таблица 6

Противомикробная активность концентрированного УКЖЛ

Микроорганизм МПК, мг/мл

Музейные штаммы микроорганизмов

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 59 ±0,35

Pseudomonas aeruginosa 9027 63 ± 0,32

Bacillus cereus 8035 63 ± 0,32

Escherichia coli 25922 72 ±0,00

Candida albicans 885-653 289 ± 0,00

Штаммы микроорганизмов, выделенные из клинического материала

Enterococcus faecalis 154 36 ±0,00

Enierococcus faecalis 127 45 ±0,23

Enterococcus faecalis 192 135 ±1,08

Klebsiella 194 81 ±0,65

Klebsiella 1 96 ±0,87

Escherichia coli 145 68 ± 0,87

Escherichia coli 1 124 ±1,49

Staphylococcus aureus 167 61 ±0,55

Staphylococcus aureus 157 65 ± 0,52

Staphylococcus aureus 1 90 ± 0,63

Staphylococcus epidermidis 100 ± 1,30

Из представленных в таблице данных видно, что к действию концентрированного УКЖЛ чувствительны как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы.

При определении чувствительности штаммов Е. coli М-17 и L. plantarum 8Р-АЗ к антибиотикам в питательную среду вводили 1% концентрата УКЖЛ. Полученные результаты представлены в табл. 7. Установлено, что без введения концентрата УКЖЛ средняя величина зоны задержки роста Е. coli М-17 составила: для ампициллина - 13,56 мм, а для гентамицина - 13,94 мм. Эти значения (11-15 мм по Биргеру, 1982) показывают, что Е. coli М-17 мало чувствительна к данным антибиотикам.

Таблица 7

Влияние концентрата УКЖЛ на чувствительность Б. coli М-17 и L. plantarum 8Р-АЗ

к антибиотикам

Питательная среда Диаметр зоны задержки роста Е. coli М-17 , мм Диаметр зоны задержки роста L. plantarum 8Р-АЗ , мм

Ампициллин Гентамицин Ампициллин Гентамицин

Контроль (без УКЖЛ) 13,56±0,51 13,94±0,63 18,79±0,41 11,71+0,27

Опыт (с УКЖЛ) 17,63±0,60* 14,06+0,41 18,56+0,27 7,38+0,96*

Примечание. * -/><0,001 по /-критерию Стъюдента в сравнении с контролем.

При введении в питательную среду концентрата УКЖЛ зоны задержки роста данного тест-штамма увеличиваются до 17,63 мм для ампициллина; для гентамицина - до 14,06 мм. Таким образом, совместное использование ампициллина и концентрированного УКЖЛ повышает чувствительность Е. соН М-17 к указанным антибиотикам, что имеет большое практическое значение.

При изучении влияния концентрированного УКЖЛ на чувствительность Ь. р1ап1агиш 8Р-АЗ к антибиотикам установлено, что при его введении в питательную среду зоны задержки роста лактобактерий в случае использования гентамицина уменьшаются на 4,33 мм, а при применении ампициллина - изменяются незначительно. Это показывает возможность использования концентрированного УКЖЛ при антибиотикотерапии для сохранения состава нормофлоры.

Полученные данные свидетельствуют о наличии в нативном и сохранении в концентрированном УКЖЛ комплекса метаболитов, обладающих пробиотической и проти-вомикробной активностью. Это обусловило целесообразность разработки на основе концентрата УКЖЛ новых лечебно-профилактических средств в виде лекарственных форм для наружного применения (вагинальные суппозитории и мазь защитного действия).

Разработка технологии и оцепка качества мягких лекарственных форм на основе метаболитов лактобактерий (Глава 4)

При разработке технологии суппозиториев проведено исследование по изучению влияния состава и способа получения лекарственной формы на устойчивость дифильной системы, содержащей в качестве гидрофильной фазы концентрат УКЖЛ.

В предварительных исследованиях установлено, что при получении суппозиториев с концентратом УКЖЛ целесообразно использовать дифильную суппозиторную основу адсорбционного типа с добавлением эмульгатора. Количество гидрофильной фазы не должно превышать 25%.

Для обоснования оптимального состава и технологии суппозиториев вагинальных с концентратом УКЖЛ применяли математический метод планирования эксперимента по типу греко-латинского квадрата (4x4). В работе изучено влияние следующих факторов: А - процент гидрофильной части (концентрированный УКЖЛ: а 1 - 10%, а 2 - 15%, а 3-20%, а 4 - 25%);

В - вид эмульгатора: (в 1- смесь эмульгаторов Т-2 и МГД в соотношении 1:1, в 2 - Т-2 (5%), в 3 - МГД (5%), в 4 - пентол (2%));

С - способ введения эмульгатора: (с 1 - введение в водную фазу, с 2 - введение в липо-фильную фазу, с 3 - введение 1А часть в водную часть и Vi в липофильную часть, с 4 -эмульгатор не вводят);

D - природа гидрофобной фазы: (d 1 - витепсол W35H15 (1:1), d 2 — витепсол W35, d 3 -витепсол Н15, d 4 - жир Себао).

Параметрами оптимизации служили: термическая стабильность, скорость высвобождения молочной кислоты из суппозиториев в агаровый гель, рН эмульсии (табл. 8).

Дисперсионный анализ полученных данных по критерию Фишера показал, что на высвобождение молочной кислоты влияют вид эмульгатора (F расч. 4,81 > F кр. 4,76) и способ введения в суппозитории (F расч. 14,83 > F кр. 4,76). Наибольшее высвобождение молочной кислоты наблюдали из суппозиториев на основе витепсол W35H15 (смеси 1:1) с эмульгатором Т-2 > смесь Т-2 и МГД > МГД > пентол при следующем способе его введения: в водную и липофильную фазы > водную фазу > липофильную фазу. На термостабильность оказывает влияние вид основы (F расч. 7,6 > F кр. 4,76). Более высокой термо-стабилыюстыо обладали суппозитории на основе W35H15.

Таблица 8

Матрица планирования эксперимента и результаты определения

параметров оптимизации

Состав Факторы Па раметры оптимизации

А В С D Термическая стабильность суппозиторных масс Скорость высвобождения молочной кислоты, мм рн эмульсии

] а 1 Ы с 1 d 1 0,100±0,005 18,0±0,5 4,90±0,05

2 а 1 b 2 с 2 d 2 0,250±0,010 14,0±0,5 5,30±0,05

3 а 1 ЬЗ сЗ d 3 0,150±0,005 15,0±1,0 5,30±0,10

4 а 1 Ь4 с4 d 4 0,270±0,005 0,0±0,0 5,30±0,10

5 а 2 Ы с2 d 3 0,120±0,010 12,3±0,5 5,70±0,05

6 а 2 Ь2 с 1 d 4 0,270±0,010 11,0±0,5 4,90±0,05

7 а 2 ЬЗ с 4 di 0,150±0,005 0,0±0,0 5,10±0,10

8 а 2 b 4 сЗ d 2 0,300±0,010 13,0±0,5 5,00±0,10

9 аЗ Ы сЗ d4 0,290*0,005 14,0±0,5 5,00±0,10

10 аЗ Ь2 с 4 d 3 0,120±0,015 0,0±0,0 5,60±0,10

И аЗ ЬЗ с 1 d2 0,200±0,005 15,0±1,0 5,50±0,05

12 аЗ b 4 с 2 di 0,160±0,005 0,0±0,0 5,40±0,10

13 а4 Ы с4 d 2 0,240±0,005 0,0*0,0 5,30±0,05

14 а 4 b 2 сЗ d 1 0,150±0,005 20,0±0,5 5,40±0,05

15 а 4 ЬЗ с 2 d 4 0,280±0,005 0,(Щ),0 5,30±0,10

16 а 4 b 4 с 1 d 3 0,220±0,010 0,0±0,0 5,40±0,10

Для изучения структурно-механических свойств использовали составы, представленные в табл. 9.

Таблица 9

Составы суппозиторных композиций, используемых в реологических испытаниях

Состав Концентрированный УКЖЛ Эмульгатор Т-2 Витепсо л W3 5Н15

1 15% 5% до 100%

2 20% 5% до 100%

3 10% 5% до 100%

4 25% 5% до 100%

Структурно-механические характеристики изучали в интервале температур 30,2 -39,8 °С (10 значений). Особый интерес представляло измерение при 30 "С (начало деформации), 37 °С (температура тела человека) и 39,8 "С (температура технологического процесса). Результаты исследований реологических показателей суппозиторных композиций при температуре тела человека (37 °С) (рис. 4), а также других температурных режимах позволили установить, что для всех вариантов характерна линейная зависимость логарифма вязкости от логарифма скорости сдвига, что характеризует данные составы как структурированные системы.

Рис. 4. График зависимости логарифма вязкости от логарифма скорости сдвига при 37 °С

При температуре 37 °С наилучшими реологическими характеристиками (широкая петля гистерезиса) обладает состав 2 (рис. 5).

260 280 300

напряжение сдвиге, Па

Рис. 5. График зависимости скорости сдвига от напряжения сдвига при 37 °С

У суппозиториев состава 2 определена температура плавления (пик -36,9 °С) на тепловом колориметре METTLER TOLEDO (Швейцария), что соответствует требованиям ГФ XI. Таким образом, в результате проведенных исследований выбран оптимальный состав суппозиториев ( %): концентрированный УКЖЛ - 20,0; эмульгатор Т-2 - 5,0; витеп-сол W35H15 до 100,0.

Для суппозиториев разработана технологическая схема, представленная на рис. 6 и включающая следующие стадии: получение УКЖЛ на установке УПЛ-0,6, его концентрирование на вакуум-выпарном аппарате, подготовка суппозиторной основы, получение суппозиторной массы, формование суппозиториев методом выливания, фасовка, упаковка и маркировка.

По предложенной технологической схеме наработано 5 экспериментальных серий суппозиториев вагинальных с концентрированным УКЖЛ, которые оценивали согласно

основным положениям общей фармакопейной статьи ГФ XI изд., вып 2.

Технологическая схема производства суппозиториев вагиналы1ых.(со стадии ТП-4 производства суппозиториев вагинальных с лактобактерином)

Шифр и наименование операций технологического процесса Лифр и наименование стадий Цифр и наименование операций воспомогательных работ

| ТП-4 | ЗР-4-1 |Подготовка посуды

Получение УКЖЛ

Приготовление бактериальной су пензнн для ультра фильтрации с- ТО-4-6 Кт, Кх,Кб ВР-4-2 Подготовка материалов для ультрафильтрации

Проведение ультрафпльтрации 6 териальной суспензии наУПЛ-0 ак-,6 ТО-4-7 ВР-4-3 Подготовка оборудования

ВР-4-4 Подготовка бокса

Концентрирование УКЖЛ на вакуум-выпарной установке ТО-5-3 ТП-5 ВР-5-1 Подготовка оборудования

Получение концентрата УКЖЛ

ТО-5-4 Кт, Кх. Кб ВР-5-2 Подготовка бокса

1

1

Подготовка суппозиторной основи ТО-6-3 ТП-6 ВР-6-1 Подготовка оборудования

I Формование суппозиториев

Подготовка концентрата УКЖЛ ТО-6-4 Кт ВР-6-2 Подготовка бокса

Получение суппозторной массы ТО-6-5

Формование суппозиториев ТО-б-б

1

Фасовка суппозиториев ТО-7-3 ТП-7 ВР-7-1 Подготовка оборудования

1 Фасовка, маркировка, упаковка

Браковка препарата ТО-7-4 ВР-7-2 Подготовка бокса

. . 1 _

Контроль препарата на производстве и в ОБТК ТО-7-5

Упаковка, маркировка препарата ТО-7-6

Рис. 6. Технологическая схема получения суппозиториев

Установлено, что суппозитории всех серий имели одинаковую форму, однородную массу, достаточную твердость, обеспечивающую удобство применения, и обладали однородностью. Однородность определяли визуально на продольном срезе по отсутствию вкраплений. Отклонения в массе суппозиториев находились в пределах ± 5%. Время пол-

ной деформации не превышало 15 минут. По микробиологической чистоте суппозитории соответствовали требованиям ГФ XII.

Суппозитории с концентрированным УКЖЛ, приготовленные на основе витепсол '\А'35Н15 с добавлением эмульгатора Т-2, были заложены на хранение в сухое, защищенное от света место при температуре (6 ± 2) °С. Для упаковки использовали бумагу упаковочную с полимерным покрытием по ТУ 64-0716-18-90. Полученные результаты показали, что при хранении в течение одного года суппозитории всех серий не изменили своих свойств и соответствовали предъявляемым требованиям по всем показателям: внешнему виду, средней массе, времени полной деформации, пробиотической активности, микробиологической чистоте. УФ - спектры, снятые у водных извлечений из суппозиториев (2), идентичны исходным УФ - спектрам и спектрам концентрата УКЖЛ (1), (рис. 7).

Рис. 7. УФ-спектры концентрированного УКЖЛ и водного извлечения из

суппозиториев

Противомикробную активность водного извлечения из суппозиториев определяли микрометодом серийных разведений. По отсутствию помутнения и изменения цвета питательной среды в лунках планшета судили о МПК. Полученные данные представлены в табл. 10.

Таблица 10

Противомикробная активность суппозиториев с концентрированным УКЖЛ

Музейные штаммы микроорганизмов

Микроорганизм МПК, мг/мл

Staphylococcus aureus АТСС 653 8Р 117 ±0,35

Pseudomonas aeruginosa 9027 126 ±0,22

Bacillus cereus 8035 126 ±0,22

Escherichia coli 25922 145 ± 0,30

Candida albicans 885-653 578 ±0,00

Применительно к музейным культурам микроорганизмов, наиболее выраженным противомикробным действием концентрированный УКЖЛ обладает в отношении Staphylococcus aureus АТСС 653 8Р (МПК составляет 117 мг/мл). Наименее чувствительным к его действию оказался штамм Candida albicans 885-653 (МПК составляет 578 мг/мл).

На основании полученных данных составлена спецификация «Суппозитории вагинальные с концентратом УКЖЛ» (табл. 11).

Таблица 11

Спецификация

Суппозитории вагинальные с концентратом УКЖЛ__

Показатель Метод Нормы

Описание Визуальный Суппозитории бежевого цвета, торпедовидной или цилиндрической формы

Время полной деформации По ГФ XI, вып.2, с.151 Не более 15 мин

Средняя масса Гравиметрический по ГФ XI, вып. 2, с. 151 3,0 г. (Отклонение ±5 % , в 2 образцах из 20 - не более ± 7,5 %)

Подлинность: 1 .наличие молочной кислоты 2.УФ-спектр Тонкослойная хроматография Значение ЯГ пятна препарата должно соответствовать М пятна молочной кислоты

Спектрофотометрический Максимум поглощения 247 ± 5 нм Минимум поглощения 265 ± 5 нм

Пробиотическая активность Спектрофотометрический Коэффициент стимуляции роста Ь. р1ап!агит 8Р-АЗ не менее 1,3

Микробиологическая чистота Бактериологический, бактериоскопический по ГФ XII, вып. 1, с. 160 Категория 2

Упаковка По 5 или 10 суппозиториев в бумаге упаковочной с полимерным покрытием по ТУ 64-0716-18-90 10 суппозиториев в картонной пачке по РД 42-28-36-90. Групповая упаковка и транспортная тара по ГОСТ 17768-90

Маркировка По РД 42-1100/1440-99-113

Транспортирование При температуре не выше 10иС

Хранение При температуре (6±2)"С в сухом, защищенном от света месте

Срок годности 1 год

Назначение Лечение больных с вагинальным цисбактериозами и неспецифиче :кими воспалительными процесса ми влагалища

Помимо использования концентрированного УКЖЛ как составного компонента вагинальных суппозиториев, представляло интерес его применение в составе мази защитного действия.

При разработке технологии мази на основе концентрата УКЖЛ учитывали, что защитные свойства обеспечиваются комплексом биологически активных метаболитных веществ и гидрофобными или эмульсионными основами типа вода/масло. В качестве гидрофобной фазы использовали растительное масло, в качестве эмульгатора (в/м) - МГД. Для повышения защитных свойств в состав мази вводили загуститель - воск. В качестве гидрофильной фазы применяли концентрированный УКЖЛ. Для подтверждения возможности использования концентрированного УКЖЛ была приготовлена мазь следующего состава: концентрированный УКЖЛ - 2%, МГД - 5%, воск желтый - 7%, масло подсолнечное до 100% и оценена ее нейтрализующая способность (рис. 9) по отношению к 0,1 М раствору №ОН. В качестве образца сравнения использовали силиконовый крем.

время, ч

Рис, 9. Зависимость количества КаОН в диализате от времени диализа

В ходе исследований установили, что защитная мазь оказывает нейтрализующее действие, сопоставимое по эффективности, с силиконовым кремом.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают широкий спектр биологических эффектов концентрированного УКЖЛ и лекарственных форм на его основе, а также возможность их использования для лечения и профилактики вагинальных дисбактериозов и защиты кожи рук от веществ щелочного характера.

1. Разработан способ подготовки метаболитного компонента для введения в лекарственные формы, включающий концентрирование УКЖЛ при температуре 90 °С и давлении (разрежении) 0,04-0,05 МПА.

2. При сравнительном изучении физико-химических характеристик исходного и концентрированного УКЖЛ установлено влияние способа подготовки на показатели плотности, кислотности и рН. Состав органических и аминокислот сохраняется при концентрировании, а их количественное содержание, наряду с низкомолекулярными пептидами и общим азотом, увеличивается пропорционально степени сгущения.

3. Микробиологическими исследованиями выявлены бактериотропные свойства нативно-го и концентрированного УКЖЛ, включая пробиотнческую активность в отношении L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus КЗШ24, а также антибактериальное действие на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Показана возможность применения концентрированного УКЖЛ при антибиотикотерапии.

4. В ходе оптимизации по плану греко-латинского квадрата и реологических исследований определен оптимальный состав суппозиториев вагинальных с концентратом УКЖЛ. Установлено, что на высвобождение молочной кислоты влияют вид эмульгатора и способ его введения, а на термостабилыюсгь - вид основы. Наибольшее высвобождение молочной кислоты наблюдали при использовании эмульгатора Т-2 и введении его в водную и липо-фильную фазу.

5. Разработана технологическая схема производства суппозиториев вагинальных с мета-болитным компонентом и проведена стандартизация (составлена спецификация), а также определен срок годности данной лекарственной формы (срок наблюдения) - 1 год.

6. Показана возможность использования концентрированного УКЖЛ в составе мази защитного действия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Несчисляев, В.А. Технологические аспекты концентрирования культурапьной жидкости лактобактерий / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина// Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы научно-практической конференции. - Москва, 2006. - С. 71-72.

2. Несчисляев, В.А. Комплексное использование биологически активных метаболитов лакто- и бифидобактерий в производстве пробиотиков / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина, И.В. Белова // Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - Пущино, 2006. - С. 175-176.

3. Молохова, Е.И. Разработка пробиотического препарата на основе ультрафильтрата культурапьной жидкости лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Л.П. Чистохина, В.А. Несчисляев // Бюллетень сибирской медицины. - Томск, 2006. - Приложение 2. -С. 111-112.

4. Сорокина, Ю.В. Антибактериальное действие концентрата культурапьной жидкости лактобактерий / Ю.В. Сорокина, Е.И. Молохова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Материалы конференции. - Пермь, 2007. - С. 103-105.

5. Несчисляев, В.А. К вопросу разработки пробиотических препаратов из культурапьной жидкости лактобактерий / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина// Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С. - А55.

6. Казьянин, A.B. / Проблемы совершенствования технологии суппозиториев, содержащих метаболиты лактобактерий / A.B. Казьянин, В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Е.Г. Арчакова, П.В. Тодер, Ю.В. Сорокина // Фундаментальная фармакологическая и фармако-клиническая практика: Материалы второй российско-китайской международной научной конференции по фармакологии. - Пермь, 2006. - С. 77-78.

7. Молохова, Е.И. Разработка технологии суппозиториев, содержащих метаболиты лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Л.П. Чистохина, В.А. Несчисляев // Вестник ПГФ А. -Пермь, 2007. - № 2. - С. 349-350.

8. Сорокина, Ю.В. Пробиотическое действие ультрафилырата культурапьной жидкости лактобактерий // Создание и перспективы применения иммунобиологических препаратов: Материалы конференции. - Пермь, 2008. - С. 86.

9. Молохова, Е.И, Потенциометрическое определение суммы органических кислот в ультрафильтрате культурапьной жидкости лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Т.Е. Рюмина // Фармация и общественное здоровье: Материалы конференции. - Екатеринбург, 2008. - С. 226-228.

10. Молохова, Е.И. Перспективные направления создания препаратов-пробиотиков / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев, Ю.В. Сорокина, A.B. Казьянин // Фармация из века в век: Труды научно-практической конференции, ч. 4. Биохимические, микробиологические, биотехнологические исследования. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 66-68.

Автор выражает благодарность сотрудникам отделения препаратов бактериотера-пии Пермского филиала НПО «Биомед», в частности кандидату медицинских наук Чисто-хиной Л.П., а также доктору медицинских наук Маслову Ю.Н. (ПГМА) за содействие в проведении микробиологических исследований; доктору химических наук Чекрышкину Ю.С. и кандидату технических наук Якушеву P.M. (Институт УрО РАН технической химии) за помощь в проведении реологических исследований и определении состава органических кислот УКЖЛ; доктору фармацевтических наук Петриченко В.М. за оказание помощи в изучении аминокислотного состава УКЖЛ.

Подписано в печать 06.05.2009 Формат 60*90/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. 1,43 л. Заказ № 90/2009.

Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел./факс. 8-901-266-59-37

 
 

Оглавление диссертации Сорокина, Юлия Васильевна :: 2009 :: Пермь

 
 

Введение диссертации по теме "Технология лекарств и организация фармацевтического дела", Сорокина, Юлия Васильевна, автореферат

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий"

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Сорокина, Юлия Васильевна