Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий

Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий - тема автореферата по фармакологии
АВТОРЕФЕРАТ
Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий - диссертация, тема по фармакологии
ДИССЕРТАЦИЯ
Сорокина, Юлия Васильевна Пермь 2009 г.
Ученая степень
кандидат фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.01
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий

На правах рукописи

СОРОКИНА ЮЛИЯ ВАСИЛЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИТОВ ЛАКТОБАКТЕРИЙ

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь-2009

003470596

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, директор по НИР ЗАО «Медисорб»

кандидат фармацевтических наук, доцент ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Молохова Елена Игоревна Несчисляев Валерий Александрович

Вдовина Галина Петровна Чиркова Маргарита Александровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»

Защита состоится «15» июня 2009 в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01. при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ГСП-277, ул. Ленина, 48, e-mail: perm@pfa.ru. факс: 2-12-94-76

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Пермской государственной фармацевтической академии (http:www.pgfa.ru) «15» мая 2009 г.

Автореферат разослан «14» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук, доцент (^р^ ИА. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительная роль дисбиозов в патогенезе большого количества заболеваний является причиной востребованности пробиотиков в медицинской практике. В настоящее время перспективным направлением в сфере разработки этих лекарственных средств является создание поликомпонентных препаратов и пробиотиков метаболитного типа. Механизм действия последних основан на регулировании симбионтных отношений организма человека и его микробиоценоза за счет компенсации дефицита метаболитов и создания благоприятных условий для развития собственной микрофлоры. Про-биотики метаболитного типа представляют собой препараты заместительной терапии и практически не оказывают побочных действий (Грачева Н.М., 2007). На отечественном фармацевтическом рынке доминирует один из представителей этой группы - «Хилак -форте» («Меркле ГмбХ»), содержащий в своем составе продукты метаболизма кишечной палочки, лактобактернй, кишечного стрептококка, а также ряд других дополнительно введенных компонентов, в том числе синтетическую молочную кислоту. Производство российских аналогов «Хилак - форте» при наличии перспективных разработок до настоящего времени не организовано.

В НИИ экспериментальной медицины (г. Санкт-Петербург) получены суперна-танты, содержащие метаболиты пробиотических культур Enterococcus faccium, и изучена их антагонистическая активность (Ермоленко Е.И. с соавт., 2007). Разработана технология препарата «Актофлор», представляющего собой низкомолекулярную фракцию культу-ральной жидкости штамма Escherichia coli М-17 (Вахитов Т.Я. с соавт., 2005). На основе гидролизатов молочнокислых бактерий вида L. acidophilus получен БАД «Биолактон» (Сенченко С.П., 2006).

В Пермском НПО «Биомед» разработан способ получения метаболитного препарата «Микростим» с использованием штамма-продуцента Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ (Не-счисляев В.А., Чистохина Л.П., 2004). В ходе исследований выявлено пробиотическое и антимикробное действие метаболитного комплекса, а также его иммуномодулирующая активность при пероральном и интравагинальном применении. Препарат «Микростим» рекомендован для профилактики и лечения дисбактериозов, кишечных инфекций, а также гнойно-септических осложнений в акушерско-гинекологической практике. Представляется актуальным более глубокое изучение состава и создание широкого спектра лекарственных форм данного метаболитного препарата на основе ультрафильтрата культуральной жидкости лактобактерий (УКЖЛ). Особый интерес вызывает создание мягких лекарственных форм (МЛФ) пробиотика, в том числе для профилактики и терапии гинекологических заболеваний.

Цель настоящего исследования - разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм (вагинальных суппозиториев и мази защитного действия) про-биотического препарата на основе метаболитов лактобактерий штамма-продуцента L. plantarum SP-A3.

Осповные задачи исследования:

1. Получить экспериментальные серии УКЖЛ штамма L. plantarum 8Р-АЗ, подобрать оптимальные условия и отработать способ его подготовки (концентрирование) для введения в лекарственные формы.

2. Провести сравнительное изучение физико-химических и биологических характеристик иативного (исходного) и концентрированного УКЖЛ.

3. Разработать состав и технологию суппозиториев вагинальных и мази защитного действия на основе концентрированного УКЖЛ.

4. Оценить качество полученных лекарственных форм метаболитного препарата и провести стандартизацию суппозиториев вагинальных с концентрированным УКЖЛ.

Научная новизна работы. Предложен способ подготовки исходного субстрата для получения лекарственных форм метаболитного препарата. Определены оптимальные параметры концентрирования нативного УКЖЛ на вакуум-выпарной установке, позволяющие значительно улучшить технологические свойства и сохранить биологическую активность.

Изучен качественный и количественный состав исходного и концентрированного УКЖЛ. Показано, что все действующие вещества сохраняются при концентрировании и их количество увеличивается пропорционально степени сгущения. У концентрированного УКЖЛ установлена пробиотическая, противомикробпая активность, а также определено его влияние на чувствительность L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 к ряду антибиотиков.

С помощью метода математического планирования, а также реологических исследований выбраны оптимальный состав и технология вагинальных суппозиториев. Показана возможность определения противомикробной активности МЛФ метаболитного препарата микрометодом серийных разведений.

Практическая значимость. Разработана рациональная технология МЛФ препарата на основе УКЖЛ, что позволяет расширить номенклатуру и повысить потребительские свойства метаболитных пробиотиков.

Составлено изменение (накопительная ведомость изменений № 24 от 18 декабря 2008 г.) к промышленному регламенту на производство лактобактерина сухого (регистрационный номер ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 1567-04), включающее концентрирование

бактериальной взвеси лакгобактерий методом ультрафильтрации для получения клеточной взвеси и бесклеточной культуральной жидкости (УЮКЛ).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО ПГФА кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии (акт внедрения от 18 апреля 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ получения, состав и свойства концентрата УЮКЛ.

2. Состав и технология суппозиториев и мази на основе метаболитного комплекса лакто-бактерий.

3. Обоснование показателей стандартизации и оценка качества полученных МЛФ.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств, посвященной 85-летию со дня рождения A.C. Саратикова» (Томск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вак-цинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на четвертом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); Международном конгрессе «Пробиотики, прсбиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург - Пермь, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященной 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» (Пермь, 2008).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ», раздел «Фармация» (№ Гос. регистрации 01.9.50 007426).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 1 статья в зкурнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит 38 таблиц и 30 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, двух глав экспериментальных исследований, выводов, библиографического списка, включающего 147 источников, из них - 27 зарубежных авторов, приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении представлены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведен обзор литературы, включающий сведения о биологических свойствах и функциях лактобактерий, их метаболитов, а также результаты технологических разработок препаратов на их основе.

Объекты н методы исследования (Глава 2)

В работе применяли УКЖЛ, полученный из бактериальной взвеси лактобактерий методом ультрафильтрации на установке УПЛ-0,6 (Россия) с использованием половоло-конных (ВПУ-15) разделительных аппаратов. Для микробиологических исследований использовали коллекционные штаммы микроорганизмов (Lactobacillus acidophilus КЗШ24, Escherichia coli M-17, Candida albicans ATCC 885-653, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus ATCC 65-38-P, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) и культуры, выделенные из клинического материала (биотоп - гинекологический тракт): Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella.

Для культивирования клеток применяли питательные среды: МРС-1; МРС-2; МРС-4; МРС-5; мясо-пептонный агар; мясо-пептонный бульон; 0,5% раствор глюкозы; среда №199 (филиал ФГУП НПО «Микроген» МЗРФ «Пермское НПО «Биомед»).

В качестве вспомогательных использовали вещества, разрешенные к применению в фармацевтической промышленности и отвечающие требованиям нормативной документации.

Определение плотности нативного и концентрированного УКЖЛ проводили с использованием ареометра (ГФ XI, вып. 1). Кислотность исходного и концентрированного УКЖЛ изучали титриметрическим методом (ФСП 42-05047298054 «Лактобактерин сухой»). Спектры поглощения исследовали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия) в диапазоне длин волн 240-350 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Количественное определение низкомолекулярных пептидов в нативном и концентрированном УКЖЛ проводили по методу Лоури и с применением биуретового реактива; содержание общего азота - с реактивом Несслера (ФС 42-3874-99). Органические кислоты определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системах: этилацетат - муравьиная кислота - вода очищенная (3:1:1); н-бутанол - муравьиная кислота - вода очищенная (30:5:10); н-пропанол - концентрированный раствор аммиака (6:4) и с помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза в системе Agilent, аминокислотный состав - методом бумажной хроматографии в системе н-бутанол - уксусная кислота - вода очищенная (4:1:2) и на аминокислотном анализаторе Биогроник 1С - 2000 (Германия).

Определение противомикробной активности концентрированного УКЖЛ и суппо-зиторного извлечения проводили по микрометоду серийных разведений (Аверьянова Н.И. с соавт., 2007). Влияние концентрата УКЖЛ, при его добавлении в питательную среду, на антагонистическую активность лактобактерий и антибиотикочувствительность штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 оценивали соответственно регламентированным методом отсроченного антагонизма (ФСП 42-05047298054) и дискодиффузионным методом согласно методическим указаниям (Москва, 1983). Определение специфической (пробио-тической) активности метаболитного комплекса включало исследование кислотообразо-вания и динамики роста культуры лактобактерий при внесешш концентрированного УКЖЛ в питательный субстрат (0,5% раствор глюкозы) (Чистохина Л.П., 2004).

Термостабильность, рН, тип эмульсий модельных суппозиторных композиций исследовали по ГОСТ Р 52343-2005. Изучение скорости высвобождения молочной кислоты из суппозиторных масс в питательную среду проводили методом диффузии в агаровый гель (МолоховаЕ.И., 2003). Структурно-механические свойства суппозиториев изучали на ротационном вискозиметре «Реотест-2.1» (Германия) с использованием устройства конус плиты при различных температурных режимах.

Защитные свойства мази определяли путем проведения диализа через полупроницаемую мембрану с последующим титрованием диализата 0,1 M раствором кислоты хлористоводородной (Молохова Е.И., 2003).

Полученные результаты обработаны методами математической статистики с использованием программы «Microsoft Excel».

Получение и сравнительное изучение свойств иативного и концентрированного ультрафнльтратов культуральнон жидкости лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ (Глава 3)

В работе по созданию МЛФ наработаны 5 серий нативного УКЖЛ. Для получения концентрата его сгущали в 10 раз на вакуум-выпарной установке с последующей стерилизацией в паровом стерилизаторе при температуре 110 °С в течение 30 минут. В ходе концентрирования подобраны условия для получения оптимального по технологическим свойствам продукта: температура - 90 "С, давление (разрежение) - 0,04-0,05 МПА, объем однократной порции в концентрирующей колбе - 200 мл. По окончании процесса получали более вязкую жидкость с характерными органолептическими показателями. Серии нативного и концентрированного УКЖЛ характеризовали по физико-химическим показателям: внешний вид, рН, плотность и кислотность, которые представлены в табл.1.

9шв»-шапмпн параметры впгап в пвцппрфнвшшп УКЙСЛ

Нативный УЮКЛ Концентрирован

№ серии Внешний вид РН Плотность, г/мл Кислотность, °Т № серии Внешний вид рН

1 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,65 ±0,10 1,014 ±0,005 31,00 ±1,50 к 1 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,60 ±0,1 С

2 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,50 ±0,10 1,016 ±0,003 40,00 ±0,70 к 2 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,1 С

3 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20 1,016 ±0,005 37,00 ±1,30 кЗ Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20

4 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 6,72 ±0,10 1,014 ±0,002 38,00 ±1,20 к 4 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 6,50 ±0,10

5 Прозрачная жидкость светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,43 ±0,20 1,016 ±0,005 46,00 ±0,90 к 5 Вязкая жидкость коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом 5,40 ±0,20

Установлено, что при концентрировании нативного УКЖЛ кислотность возрастает в пределах от 15 до 19 раз. Количественные показатели плотности увеличиваются при этом в 1,1- 1,2 раза. Во всех сериях показатели рН остались неизменными, что свидетельствует о сохранении в ходе концентрирования буферных свойств нативного УКЖЛ.

УФ-спектры концентрата УКЖЛ имеют максимум поглощения при длине волны 245,7 нм и минимум поглощения при длине волны 266,1 нм, что идентично УФ-спектрам исходного УКЖЛ.

Для нативного и концентрированного УКЖЛ определено содержание общего азота, а также белков (низкомолекулярных пептидов). Данные представлены в табл. 2.

Таблица 2

Сравнительная характеристика исходного и концентрированного УКЖЛ

по количеству азотсодержащих соединений

Исследуемый объект Общий азот, мг/мл Белок (метод Лоури), мг/мл Белок (с биуретовым реактивом), мг/мл

Нативный УКЖЛ 8,06±1,50 6,40±1,20 6,59±1,30

Концентрированный УКЖЛ 91,05±1,90 50,97±2,50 63,04±3,10

Полученные результаты свидетельствуют о том, что содержание общего азота при концентрировании увеличивается в 11,3 раза, белка по методу Лоури - в 8 раз и по методу с использованием биуретового реактива в - 9,6 раз. Таким образом, процесс сгущения су-ществено и пропорционально повышает количество азотсодержащих соединений в концентрированном УКЖЛ.

В качестве методов, позволяющих определить подлинность органических кислот в УКЖЛ, апробированы ТСХ и потенциометрическое титрование. Методом ТСХ обнаружена молочная кислота - один из основных метаболитов лакгобактерий. Установлено, что наиболее подходящей является система этилацетат - муравьиная кислота - вода очищенная (3:1:1). По результатам потенциометрического титрования построены дифференциальные и интегральные кривые, которые идентичны для нативного и концентрированного УКЖЛ, а также для водного извлечения из суппозиториев, что позволяет использовать их для подтверждения подлинности препарата (наличие концентрата УКЖЛ в МЛФ).

С целью количественного определения органических кислот получены электрофо-реграммы концентрированного и нативного УКЖЛ (рис. 1-2).

Рис. 1. Электрофореграмма концентрированного УКЖЛ, разведенного в 1000 раз

1 - пик уксусной кислоты

2 - пик молочной кислоты

г"|1п |п1о(гл«Коп к Тим Аг а Не1яМ М/И1Ь Лгв«Х ЗупиюЬу

СЕ По ! П 1 ) 17.4 О.ОЯОЭ | 8173 I 09« )

По Р<*Ь C:\HPCHEM\I \DATA\08 04 ЗСЧ Ьгх 5 «03 <! .1 | 83.5

ВЫ« ЭмвЫШо ЗОЛЫМ. 160017

Рис. 2. Электрофореграмма нативного УКЖЛ, разведенного в 100 раз

1 - пик уксусной кислоты

2 - пик молочной кислоты

С помощью высокоэффективного капиллярного электрофореза в УКЖЛ были обнаружены молочная и уксусная кислоты при отсутствии пропионовой, масляной и янтарной кислоты. Из данных, представленных в табл. 3, видно, что количество органических кислот пропорционально увеличивается при концентрировании УКЖЛ, при этом содержание молочной кислоты возрастает в 11,4 раза, а содержание уксусной кислоты - в 8,3 раза.

Таблица 3

Состав и количество органических кислот в исследуемых объектах

Анализируемый образец Содержание молочной кислоты, мг/мл Содержание уксусной кислоты, мг/мл Соотношение кислот

Нативный УКЖЛ 46,89±0,10 2,68±0,10 4,7 :0,26

Концентрат УКЖЛ 532,82±0,20 22,12±0,20 5,3 : 0,22

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при сгущении нативного УКЖЛ спектр органических кислот остается постоянным, а их количественное содержание увеличивается.

В ходе исследования аминокислотного состава нативного и концентрированного УКЖЛ методом бумажной хроматографии обнаружено и идентифицировано (путем сопоставления значений КГ пятен исследуемого образца и стандартных аминокислот) 10 аминокислот. Схема хроматограммы представлена на рис. 3.

0,9 0,8 0.7 0,6 2 0,5 0.4 0,3 0,2 0,1 о

О 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 3. Аминокислотный состав нативного и концентрированного УКЖЛ

Примечание: 1-р-аланин; 2 - лейцин; 3 - цистин; 4 - глицин; 5 -Ь-изолейцин; 6 -тирозин; 7 - Ь-аспарагин гидрохлорид; 8 - 0,Ь-орнитин; 9 - 0,Ь-серин; 10 — Ь— глутаминовая кислота; 11 - 0,Ь~лизин моногидрохлорид; 12 - Ь-метионин; 13 - Ь-глутамин; 14 - Ь-гистидин гидрохлорид; 15 - валин; 16 - пролин; 17 - нативный УКЖЛ; 18 - концентрированный УКЖЛ, разведенный водой очищенной в 10 раз.

Для расширения сведений об аминокислотном составе нативного и концентрированного УКЖЛ проведены исследования на аминокислотном анализаторе. В ходе анализа обнаружен широкий спектр аминокислот: аспарагиновая, треонин, серин, глутаминовая, пролин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, ли-

зин, гистидин, аргинин (16 аминокислот) и определено их количество в свободном и связанном состоянии.

Микробиологическими исследованиями установлена пробиотическая активность концентрата, его стимулирующее влияние на рост штаммов L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus K3I1124 (наблюдали прирост оптической плотности бактериальной взвеси). Данные представлены в табл. 4.

Таблица 4

Стимулирующее влияние концентрированного УКЖЛ на рост различных

штаммов лактобактерий

Исследуемые штаммы Величина прироста оптической плотности через 24-48 ч, D540 Коэффициент стимуляции роста

Контроль Добавление в питательную среду концентрата УКЖЛ

L. plantarum 8Р-АЗ 0,140±0,010 0,370±0,01* 2,57

L. acidophilus КЗШ24 0,011+0,003 0,079+0,012* 7,00

Примечание. * -j9<0,001 по /-критерию Стыодента в сравнении с контролем.

Концентрат УОШ стимулировал рост лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ, увеличивая оптическую мутность культуры в 2,57 раза, a L. acidophilus КЗШ24 - в 7 раз. Для определения метаболитного воздействия на биохимические свойства лактобактерий оценивали влияние концентрата на активность кислотообразования L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus КЗШ24.

Таблица 5

Стимулирующее влияние концентрированного УКЖЛ на активность

кислотообразования различных штаммов лактобактерий

Исследуемые штаммы Величина прироста общей кислотности через 24-48 ч, °Т Коэффициент стимуляции кислотообразования

Контроль Добавление в питательную среду концентрата УКЖЛ

L. plantarum 8Р-АЗ 26,11+2,12 34,22±0,59* 1,31

L. acidophilus K3IU24 2,25±0,75 17,63±1,95** 7,83

Примечание. * - /КО,01; ** - /?<0,001 по /-критерию Стыодента в сравнении с контролем.

Установлено, что активность кислотообразования усилилась у L. plantarum 8Р-АЗ в 1,31 раз, а у L. acidophilus КЗШ24 - в 7,83 раза (табл. 5).

Для концентрированного УКЖЛ определена противомикробная активность в отношении музейных и клинических штаммов микроорганизмов. Параметры МПК (мини-

мальная подавляющая концентрация) включены в табл. 6.

Таблица 6

Противомикробная активность концентрированного УКЖЛ

Микроорганизм МПК, мг/мл

Музейные штаммы микроорганизмов

Staphylococcus aureus ATCC 6538P 59 ±0,35

Pseudomonas aeruginosa 9027 63 ± 0,32

Bacillus cereus 8035 63 ± 0,32

Escherichia coli 25922 72 ±0,00

Candida albicans 885-653 289 ± 0,00

Штаммы микроорганизмов, выделенные из клинического материала

Enterococcus faecalis 154 36 ±0,00

Enierococcus faecalis 127 45 ±0,23

Enterococcus faecalis 192 135 ±1,08

Klebsiella 194 81 ±0,65

Klebsiella 1 96 ±0,87

Escherichia coli 145 68 ± 0,87

Escherichia coli 1 124 ±1,49

Staphylococcus aureus 167 61 ±0,55

Staphylococcus aureus 157 65 ± 0,52

Staphylococcus aureus 1 90 ± 0,63

Staphylococcus epidermidis 100 ± 1,30

Из представленных в таблице данных видно, что к действию концентрированного УКЖЛ чувствительны как грамположительные, так и грамотрицательные микроорганизмы.

При определении чувствительности штаммов Е. coli М-17 и L. plantarum 8Р-АЗ к антибиотикам в питательную среду вводили 1% концентрата УКЖЛ. Полученные результаты представлены в табл. 7. Установлено, что без введения концентрата УКЖЛ средняя величина зоны задержки роста Е. coli М-17 составила: для ампициллина - 13,56 мм, а для гентамицина - 13,94 мм. Эти значения (11-15 мм по Биргеру, 1982) показывают, что Е. coli М-17 мало чувствительна к данным антибиотикам.

Таблица 7

Влияние концентрата УКЖЛ на чувствительность Б. coli М-17 и L. plantarum 8Р-АЗ

к антибиотикам

Питательная среда Диаметр зоны задержки роста Е. coli М-17 , мм Диаметр зоны задержки роста L. plantarum 8Р-АЗ , мм

Ампициллин Гентамицин Ампициллин Гентамицин

Контроль (без УКЖЛ) 13,56±0,51 13,94±0,63 18,79±0,41 11,71+0,27

Опыт (с УКЖЛ) 17,63±0,60* 14,06+0,41 18,56+0,27 7,38+0,96*

Примечание. * -/><0,001 по /-критерию Стъюдента в сравнении с контролем.

При введении в питательную среду концентрата УКЖЛ зоны задержки роста данного тест-штамма увеличиваются до 17,63 мм для ампициллина; для гентамицина - до 14,06 мм. Таким образом, совместное использование ампициллина и концентрированного УКЖЛ повышает чувствительность Е. соН М-17 к указанным антибиотикам, что имеет большое практическое значение.

При изучении влияния концентрированного УКЖЛ на чувствительность Ь. р1ап1агиш 8Р-АЗ к антибиотикам установлено, что при его введении в питательную среду зоны задержки роста лактобактерий в случае использования гентамицина уменьшаются на 4,33 мм, а при применении ампициллина - изменяются незначительно. Это показывает возможность использования концентрированного УКЖЛ при антибиотикотерапии для сохранения состава нормофлоры.

Полученные данные свидетельствуют о наличии в нативном и сохранении в концентрированном УКЖЛ комплекса метаболитов, обладающих пробиотической и проти-вомикробной активностью. Это обусловило целесообразность разработки на основе концентрата УКЖЛ новых лечебно-профилактических средств в виде лекарственных форм для наружного применения (вагинальные суппозитории и мазь защитного действия).

Разработка технологии и оцепка качества мягких лекарственных форм на основе метаболитов лактобактерий (Глава 4)

При разработке технологии суппозиториев проведено исследование по изучению влияния состава и способа получения лекарственной формы на устойчивость дифильной системы, содержащей в качестве гидрофильной фазы концентрат УКЖЛ.

В предварительных исследованиях установлено, что при получении суппозиториев с концентратом УКЖЛ целесообразно использовать дифильную суппозиторную основу адсорбционного типа с добавлением эмульгатора. Количество гидрофильной фазы не должно превышать 25%.

Для обоснования оптимального состава и технологии суппозиториев вагинальных с концентратом УКЖЛ применяли математический метод планирования эксперимента по типу греко-латинского квадрата (4x4). В работе изучено влияние следующих факторов: А - процент гидрофильной части (концентрированный УКЖЛ: а 1 - 10%, а 2 - 15%, а 3-20%, а 4 - 25%);

В - вид эмульгатора: (в 1- смесь эмульгаторов Т-2 и МГД в соотношении 1:1, в 2 - Т-2 (5%), в 3 - МГД (5%), в 4 - пентол (2%));

С - способ введения эмульгатора: (с 1 - введение в водную фазу, с 2 - введение в липо-фильную фазу, с 3 - введение 1А часть в водную часть и Vi в липофильную часть, с 4 -эмульгатор не вводят);

D - природа гидрофобной фазы: (d 1 - витепсол W35H15 (1:1), d 2 — витепсол W35, d 3 -витепсол Н15, d 4 - жир Себао).

Параметрами оптимизации служили: термическая стабильность, скорость высвобождения молочной кислоты из суппозиториев в агаровый гель, рН эмульсии (табл. 8).

Дисперсионный анализ полученных данных по критерию Фишера показал, что на высвобождение молочной кислоты влияют вид эмульгатора (F расч. 4,81 > F кр. 4,76) и способ введения в суппозитории (F расч. 14,83 > F кр. 4,76). Наибольшее высвобождение молочной кислоты наблюдали из суппозиториев на основе витепсол W35H15 (смеси 1:1) с эмульгатором Т-2 > смесь Т-2 и МГД > МГД > пентол при следующем способе его введения: в водную и липофильную фазы > водную фазу > липофильную фазу. На термостабильность оказывает влияние вид основы (F расч. 7,6 > F кр. 4,76). Более высокой термо-стабилыюстыо обладали суппозитории на основе W35H15.

Таблица 8

Матрица планирования эксперимента и результаты определения

параметров оптимизации

Состав Факторы Па раметры оптимизации

А В С D Термическая стабильность суппозиторных масс Скорость высвобождения молочной кислоты, мм рн эмульсии

] а 1 Ы с 1 d 1 0,100±0,005 18,0±0,5 4,90±0,05

2 а 1 b 2 с 2 d 2 0,250±0,010 14,0±0,5 5,30±0,05

3 а 1 ЬЗ сЗ d 3 0,150±0,005 15,0±1,0 5,30±0,10

4 а 1 Ь4 с4 d 4 0,270±0,005 0,0±0,0 5,30±0,10

5 а 2 Ы с2 d 3 0,120±0,010 12,3±0,5 5,70±0,05

6 а 2 Ь2 с 1 d 4 0,270±0,010 11,0±0,5 4,90±0,05

7 а 2 ЬЗ с 4 di 0,150±0,005 0,0±0,0 5,10±0,10

8 а 2 b 4 сЗ d 2 0,300±0,010 13,0±0,5 5,00±0,10

9 аЗ Ы сЗ d4 0,290*0,005 14,0±0,5 5,00±0,10

10 аЗ Ь2 с 4 d 3 0,120±0,015 0,0±0,0 5,60±0,10

И аЗ ЬЗ с 1 d2 0,200±0,005 15,0±1,0 5,50±0,05

12 аЗ b 4 с 2 di 0,160±0,005 0,0±0,0 5,40±0,10

13 а4 Ы с4 d 2 0,240±0,005 0,0*0,0 5,30±0,05

14 а 4 b 2 сЗ d 1 0,150±0,005 20,0±0,5 5,40±0,05

15 а 4 ЬЗ с 2 d 4 0,280±0,005 0,(Щ),0 5,30±0,10

16 а 4 b 4 с 1 d 3 0,220±0,010 0,0±0,0 5,40±0,10

Для изучения структурно-механических свойств использовали составы, представленные в табл. 9.

Таблица 9

Составы суппозиторных композиций, используемых в реологических испытаниях

Состав Концентрированный УКЖЛ Эмульгатор Т-2 Витепсо л W3 5Н15

1 15% 5% до 100%

2 20% 5% до 100%

3 10% 5% до 100%

4 25% 5% до 100%

Структурно-механические характеристики изучали в интервале температур 30,2 -39,8 °С (10 значений). Особый интерес представляло измерение при 30 "С (начало деформации), 37 °С (температура тела человека) и 39,8 "С (температура технологического процесса). Результаты исследований реологических показателей суппозиторных композиций при температуре тела человека (37 °С) (рис. 4), а также других температурных режимах позволили установить, что для всех вариантов характерна линейная зависимость логарифма вязкости от логарифма скорости сдвига, что характеризует данные составы как структурированные системы.

Рис. 4. График зависимости логарифма вязкости от логарифма скорости сдвига при 37 °С

При температуре 37 °С наилучшими реологическими характеристиками (широкая петля гистерезиса) обладает состав 2 (рис. 5).

260 280 300

напряжение сдвиге, Па

Рис. 5. График зависимости скорости сдвига от напряжения сдвига при 37 °С

У суппозиториев состава 2 определена температура плавления (пик -36,9 °С) на тепловом колориметре METTLER TOLEDO (Швейцария), что соответствует требованиям ГФ XI. Таким образом, в результате проведенных исследований выбран оптимальный состав суппозиториев ( %): концентрированный УКЖЛ - 20,0; эмульгатор Т-2 - 5,0; витеп-сол W35H15 до 100,0.

Для суппозиториев разработана технологическая схема, представленная на рис. 6 и включающая следующие стадии: получение УКЖЛ на установке УПЛ-0,6, его концентрирование на вакуум-выпарном аппарате, подготовка суппозиторной основы, получение суппозиторной массы, формование суппозиториев методом выливания, фасовка, упаковка и маркировка.

По предложенной технологической схеме наработано 5 экспериментальных серий суппозиториев вагинальных с концентрированным УКЖЛ, которые оценивали согласно

основным положениям общей фармакопейной статьи ГФ XI изд., вып 2.

Технологическая схема производства суппозиториев вагиналы1ых.(со стадии ТП-4 производства суппозиториев вагинальных с лактобактерином)

Шифр и наименование операций технологического процесса Лифр и наименование стадий Цифр и наименование операций воспомогательных работ

| ТП-4 | ЗР-4-1 |Подготовка посуды

Получение УКЖЛ

Приготовление бактериальной су пензнн для ультра фильтрации с- ТО-4-6 Кт, Кх,Кб ВР-4-2 Подготовка материалов для ультрафильтрации

Проведение ультрафпльтрации 6 териальной суспензии наУПЛ-0 ак-,6 ТО-4-7 ВР-4-3 Подготовка оборудования

ВР-4-4 Подготовка бокса

Концентрирование УКЖЛ на вакуум-выпарной установке ТО-5-3 ТП-5 ВР-5-1 Подготовка оборудования

Получение концентрата УКЖЛ

ТО-5-4 Кт, Кх. Кб ВР-5-2 Подготовка бокса

1

1

Подготовка суппозиторной основи ТО-6-3 ТП-6 ВР-6-1 Подготовка оборудования

I Формование суппозиториев

Подготовка концентрата УКЖЛ ТО-6-4 Кт ВР-6-2 Подготовка бокса

Получение суппозторной массы ТО-6-5

Формование суппозиториев ТО-б-б

1

Фасовка суппозиториев ТО-7-3 ТП-7 ВР-7-1 Подготовка оборудования

1 Фасовка, маркировка, упаковка

Браковка препарата ТО-7-4 ВР-7-2 Подготовка бокса

. . 1 _

Контроль препарата на производстве и в ОБТК ТО-7-5

Упаковка, маркировка препарата ТО-7-6

Рис. 6. Технологическая схема получения суппозиториев

Установлено, что суппозитории всех серий имели одинаковую форму, однородную массу, достаточную твердость, обеспечивающую удобство применения, и обладали однородностью. Однородность определяли визуально на продольном срезе по отсутствию вкраплений. Отклонения в массе суппозиториев находились в пределах ± 5%. Время пол-

ной деформации не превышало 15 минут. По микробиологической чистоте суппозитории соответствовали требованиям ГФ XII.

Суппозитории с концентрированным УКЖЛ, приготовленные на основе витепсол '\А'35Н15 с добавлением эмульгатора Т-2, были заложены на хранение в сухое, защищенное от света место при температуре (6 ± 2) °С. Для упаковки использовали бумагу упаковочную с полимерным покрытием по ТУ 64-0716-18-90. Полученные результаты показали, что при хранении в течение одного года суппозитории всех серий не изменили своих свойств и соответствовали предъявляемым требованиям по всем показателям: внешнему виду, средней массе, времени полной деформации, пробиотической активности, микробиологической чистоте. УФ - спектры, снятые у водных извлечений из суппозиториев (2), идентичны исходным УФ - спектрам и спектрам концентрата УКЖЛ (1), (рис. 7).

Рис. 7. УФ-спектры концентрированного УКЖЛ и водного извлечения из

суппозиториев

Противомикробную активность водного извлечения из суппозиториев определяли микрометодом серийных разведений. По отсутствию помутнения и изменения цвета питательной среды в лунках планшета судили о МПК. Полученные данные представлены в табл. 10.

Таблица 10

Противомикробная активность суппозиториев с концентрированным УКЖЛ

Музейные штаммы микроорганизмов

Микроорганизм МПК, мг/мл

Staphylococcus aureus АТСС 653 8Р 117 ±0,35

Pseudomonas aeruginosa 9027 126 ±0,22

Bacillus cereus 8035 126 ±0,22

Escherichia coli 25922 145 ± 0,30

Candida albicans 885-653 578 ±0,00

Применительно к музейным культурам микроорганизмов, наиболее выраженным противомикробным действием концентрированный УКЖЛ обладает в отношении Staphylococcus aureus АТСС 653 8Р (МПК составляет 117 мг/мл). Наименее чувствительным к его действию оказался штамм Candida albicans 885-653 (МПК составляет 578 мг/мл).

На основании полученных данных составлена спецификация «Суппозитории вагинальные с концентратом УКЖЛ» (табл. 11).

Таблица 11

Спецификация

Суппозитории вагинальные с концентратом УКЖЛ__

Показатель Метод Нормы

Описание Визуальный Суппозитории бежевого цвета, торпедовидной или цилиндрической формы

Время полной деформации По ГФ XI, вып.2, с.151 Не более 15 мин

Средняя масса Гравиметрический по ГФ XI, вып. 2, с. 151 3,0 г. (Отклонение ±5 % , в 2 образцах из 20 - не более ± 7,5 %)

Подлинность: 1 .наличие молочной кислоты 2.УФ-спектр Тонкослойная хроматография Значение ЯГ пятна препарата должно соответствовать М пятна молочной кислоты

Спектрофотометрический Максимум поглощения 247 ± 5 нм Минимум поглощения 265 ± 5 нм

Пробиотическая активность Спектрофотометрический Коэффициент стимуляции роста Ь. р1ап!агит 8Р-АЗ не менее 1,3

Микробиологическая чистота Бактериологический, бактериоскопический по ГФ XII, вып. 1, с. 160 Категория 2

Упаковка По 5 или 10 суппозиториев в бумаге упаковочной с полимерным покрытием по ТУ 64-0716-18-90 10 суппозиториев в картонной пачке по РД 42-28-36-90. Групповая упаковка и транспортная тара по ГОСТ 17768-90

Маркировка По РД 42-1100/1440-99-113

Транспортирование При температуре не выше 10иС

Хранение При температуре (6±2)"С в сухом, защищенном от света месте

Срок годности 1 год

Назначение Лечение больных с вагинальным цисбактериозами и неспецифиче :кими воспалительными процесса ми влагалища

Помимо использования концентрированного УКЖЛ как составного компонента вагинальных суппозиториев, представляло интерес его применение в составе мази защитного действия.

При разработке технологии мази на основе концентрата УКЖЛ учитывали, что защитные свойства обеспечиваются комплексом биологически активных метаболитных веществ и гидрофобными или эмульсионными основами типа вода/масло. В качестве гидрофобной фазы использовали растительное масло, в качестве эмульгатора (в/м) - МГД. Для повышения защитных свойств в состав мази вводили загуститель - воск. В качестве гидрофильной фазы применяли концентрированный УКЖЛ. Для подтверждения возможности использования концентрированного УКЖЛ была приготовлена мазь следующего состава: концентрированный УКЖЛ - 2%, МГД - 5%, воск желтый - 7%, масло подсолнечное до 100% и оценена ее нейтрализующая способность (рис. 9) по отношению к 0,1 М раствору №ОН. В качестве образца сравнения использовали силиконовый крем.

время, ч

Рис, 9. Зависимость количества КаОН в диализате от времени диализа

В ходе исследований установили, что защитная мазь оказывает нейтрализующее действие, сопоставимое по эффективности, с силиконовым кремом.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают широкий спектр биологических эффектов концентрированного УКЖЛ и лекарственных форм на его основе, а также возможность их использования для лечения и профилактики вагинальных дисбактериозов и защиты кожи рук от веществ щелочного характера.

1. Разработан способ подготовки метаболитного компонента для введения в лекарственные формы, включающий концентрирование УКЖЛ при температуре 90 °С и давлении (разрежении) 0,04-0,05 МПА.

2. При сравнительном изучении физико-химических характеристик исходного и концентрированного УКЖЛ установлено влияние способа подготовки на показатели плотности, кислотности и рН. Состав органических и аминокислот сохраняется при концентрировании, а их количественное содержание, наряду с низкомолекулярными пептидами и общим азотом, увеличивается пропорционально степени сгущения.

3. Микробиологическими исследованиями выявлены бактериотропные свойства нативно-го и концентрированного УКЖЛ, включая пробиотнческую активность в отношении L. plantarum 8Р-АЗ и L. acidophilus КЗШ24, а также антибактериальное действие на условно-патогенные и патогенные микроорганизмы. Показана возможность применения концентрированного УКЖЛ при антибиотикотерапии.

4. В ходе оптимизации по плану греко-латинского квадрата и реологических исследований определен оптимальный состав суппозиториев вагинальных с концентратом УКЖЛ. Установлено, что на высвобождение молочной кислоты влияют вид эмульгатора и способ его введения, а на термостабилыюсгь - вид основы. Наибольшее высвобождение молочной кислоты наблюдали при использовании эмульгатора Т-2 и введении его в водную и липо-фильную фазу.

5. Разработана технологическая схема производства суппозиториев вагинальных с мета-болитным компонентом и проведена стандартизация (составлена спецификация), а также определен срок годности данной лекарственной формы (срок наблюдения) - 1 год.

6. Показана возможность использования концентрированного УКЖЛ в составе мази защитного действия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Несчисляев, В.А. Технологические аспекты концентрирования культурапьной жидкости лактобактерий / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина// Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы научно-практической конференции. - Москва, 2006. - С. 71-72.

2. Несчисляев, В.А. Комплексное использование биологически активных метаболитов лакто- и бифидобактерий в производстве пробиотиков / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина, И.В. Белова // Материалы четвертого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - Пущино, 2006. - С. 175-176.

3. Молохова, Е.И. Разработка пробиотического препарата на основе ультрафильтрата культурапьной жидкости лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Л.П. Чистохина, В.А. Несчисляев // Бюллетень сибирской медицины. - Томск, 2006. - Приложение 2. -С. 111-112.

4. Сорокина, Ю.В. Антибактериальное действие концентрата культурапьной жидкости лактобактерий / Ю.В. Сорокина, Е.И. Молохова // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии: Материалы конференции. - Пермь, 2007. - С. 103-105.

5. Несчисляев, В.А. К вопросу разработки пробиотических препаратов из культурапьной жидкости лактобактерий / В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Ю.В. Сорокина// Клиническое питание. - 2007. - № 1-2. - С. - А55.

6. Казьянин, A.B. / Проблемы совершенствования технологии суппозиториев, содержащих метаболиты лактобактерий / A.B. Казьянин, В.А. Несчисляев, Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, Е.Г. Арчакова, П.В. Тодер, Ю.В. Сорокина // Фундаментальная фармакологическая и фармако-клиническая практика: Материалы второй российско-китайской международной научной конференции по фармакологии. - Пермь, 2006. - С. 77-78.

7. Молохова, Е.И. Разработка технологии суппозиториев, содержащих метаболиты лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Л.П. Чистохина, В.А. Несчисляев // Вестник ПГФ А. -Пермь, 2007. - № 2. - С. 349-350.

8. Сорокина, Ю.В. Пробиотическое действие ультрафилырата культурапьной жидкости лактобактерий // Создание и перспективы применения иммунобиологических препаратов: Материалы конференции. - Пермь, 2008. - С. 86.

9. Молохова, Е.И, Потенциометрическое определение суммы органических кислот в ультрафильтрате культурапьной жидкости лактобактерий / Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина, Т.Е. Рюмина // Фармация и общественное здоровье: Материалы конференции. - Екатеринбург, 2008. - С. 226-228.

10. Молохова, Е.И. Перспективные направления создания препаратов-пробиотиков / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев, Ю.В. Сорокина, A.B. Казьянин // Фармация из века в век: Труды научно-практической конференции, ч. 4. Биохимические, микробиологические, биотехнологические исследования. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 66-68.

Автор выражает благодарность сотрудникам отделения препаратов бактериотера-пии Пермского филиала НПО «Биомед», в частности кандидату медицинских наук Чисто-хиной Л.П., а также доктору медицинских наук Маслову Ю.Н. (ПГМА) за содействие в проведении микробиологических исследований; доктору химических наук Чекрышкину Ю.С. и кандидату технических наук Якушеву P.M. (Институт УрО РАН технической химии) за помощь в проведении реологических исследований и определении состава органических кислот УКЖЛ; доктору фармацевтических наук Петриченко В.М. за оказание помощи в изучении аминокислотного состава УКЖЛ.

Подписано в печать 06.05.2009 Формат 60*90/16. Набор компьютерный. Бумага ВХИ. Тираж 100 экз. Усл. печ. 1,43 л. Заказ № 90/2009.

Отпечатано на ризографе в типографии ГОУ ВПО ПГФА 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46, тел./факс. 8-901-266-59-37

 
 

Оглавление диссертации Сорокина, Юлия Васильевна :: 2009 :: Пермь

ВВЕДЕНИЕ

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Лактобактерии: биологические свойства, функции и лекарственные препараты

1.2. Свойства метаболитов лактобактерий.

1.3. Технологические разработки лекарственных препаратов на основе бактериальных метаболитов.

Глава 2. Объекты и методы исследований

2.1. Объекты.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Физико-химические методы.

2.2.2. Микробиологические методы.

2.2.3. Статистические методы.

Глава 3. Получение и сравнительное изучение свойств нативного и концентрированного ультрафильтратов культуральной жидкости лактобактерий штамма L. plantarum 8Р-АЗ

3.1. Выбор параметров концентрирования УКЖЛ.

3.2. Изучение физико-химических параметров нативного и концентрированного УКЖЛ.

3.2.1. Определение плотности, титруемой кислотности и рН

3.2.2. Влияние процесса концентрирования на азотистый состав УКЖЛ

3.2.3. Исследование состава органических кислот в нативном и концентрированном УКЖЛ

3.2.4. Определение состава аминокислот методом бумажной хроматографии и с помощью высокоскоростного аминокислотного анализатора

3.3. Сравнительная оценка бактериотропного действия нативного и концентрированного УКЖЛ.

3.3.1. Изучение специфической (пробиотической) активности.

3.3.2. Изучение антагонистической активности

3.3.3. Оценка антибактериального действия.

3.3.4. Исследование влияния нативного и концентрированного УКЖЛ на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам.

Выводы по главе.

Глава 4. Разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий.

4.1. Технология и оценка качества суппозиториев вагинальных, содержащих концентрат УКЖЛ

4.1.1. Исследование влияния составов суппозиторных масс на качество лекарственных форм с концентрированным УКЖЛ

4.1.2. Оптимизация технологии суппозиториев с концентратом УКЖЛ.

4.1.3. Исследование реологических параметров суппозиторных

4.1.4. Составление технологической схемы производства суппозиториев с концентратом УКЖЛ.

4.1.5. Стандартизация суппозиториев с концентратом УКЖЛ.

4.2. Технология и оценка качества мази защитного действия-.

 
 

Введение диссертации по теме "Технология лекарств и организация фармацевтического дела", Сорокина, Юлия Васильевна, автореферат

Актуальность темы. В настоящее время наблюдается расширение номенклатуры пробиотических препаратов. Перспективным направлением в этой области является разработка пробиотиков метаболитного типа. Данная группа пробиотиков осуществляет регулирование симбионтных отношений организма человека и его микрофлоры за счет компенсации метаболитов и создает благоприятные условия для развития собственной микрофлоры. Про-биотики метаболитного типа представляют собой препараты заместительной терапии и практически не оказывают побочных действий (Грачева Н.М., 2007).

Один из препаратов, содержащих микробные метаболиты, широко используемый на отечественном фармацевтическом рынке - Хилак - форте (Меркле ГмБХ, Германия). Препарат представляет собой капли для приема внутрь и содержит в своем составе концентрат продуктов метаболизма саха-ролитических (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Enterococcus faecalis) и протеолитических (Escherichia coli) микроорганизмов (беззародышевые водные субстраты продуктов обмена веществ). В его состав дополнительно введены молочная, фосфорная и лимонная кислоты, сорбат калия, сбалансированный состав буферных солей (кислый фосфорнокислый натрий и калий), лактоза и ряд аминокислот.

В Пермском НПО «Биомед» (Несчисляев В.А., Чистохина Л.П., 2004) разработан способ получения препарата «Микростим» на основе метаболитов Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ. В ходе исследований установлена выраженная пробиотическая и антимикробная активность препарата. При изучении влияния метаболитного препарата на иммунную систему установлена его иммуномодулирующая активность при пероральном и интравагинальном применении.

Для разработки технологии и стандартизации лекарственных форм препарата «Микростим» необходимо изучение состава ультрафильтрата культуральной жидкости лактобактерий и условий его концентрирования, что определило актуальность проведенных исследований. Особенно актуальным является создание мягких лекарственных форм на основе метаболитов лактобактерий для профилактики и терапии гинекологических заболеваний.

Цель настоящего исследования - разработка технологии и оценка качества мягких лекарственных форм (вагинальных суппозиториев и мази защитного действия) пробиотического препарата на основе метаболитов лактобактерий штамма-продуцента L. plantarum 8Р-АЗ. Основные задачи исследования:

1. Получить экспериментальные серии УКЖЛ штамма L. plantarum 8Р-АЗ, подобрать оптимальные условия и отработать способ его подготовки (концентрирование) для получения лекарственных форм.

2. Провести сравнительное изучение физико-химических и биологических характеристик нативного (исходного) и концентрированного УКЖЛ.

3. Разработать состав и технологию суппозиториев вагинальных и мази защитного действия на основе концентрированного УКЖЛ.

4. Оценить качество полученных лекарственных форм метаболитного препарата и провести стандартизацию суппозиториев вагинальных с концентрированным УКЖЛ.

Научная новизна работы. Предложен способ подготовки исходного субстрата для получения лекарственных форм метаболитного препарата. Определены оптимальные параметры концентрирования нативного УЮКЛ на вакуум-выпарной установке, позволяющие значительно улучшить технологические свойства и сохранить биологическую активность.

Изучен качественный и количественный состав исходного и концентрированного УКЖЛ. Показано, что все действующие вещества сохраняются при концентрировании и их количество увеличивается пропорционально степени сгущения. У концентрированного УЮКЛ установлена пробиотическая, противомикробная активность, а также определено его влияние на чувствительность L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 к ряду антибиотиков.

С помощью метода математического планирования, а также реологических исследований выбраны оптимальный состав и технология вагинальных суппозиториев. Показана возможность определения противомикробной активности МЛФ метаболитного препарата микрометодом серийных разведений.

Практическая значимость. Разработана рациональная технология МЛФ препарата на основе УКЖЛ, что позволяет расширить номенклатуру и повысить потребительские свойства метаболитных пробиотиков.

Составлено изменение (накопительная ведомость изменений № 24 от 18 декабря 2008 г.) к промышленному регламенту на производство лактобак-терина сухого (регистрационный номер ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 156704), включающее концентрирование бактериальной взвеси лактобактерий методом ультрафильтрации для получения клеточной взвеси и бесклеточной культуральной жидкости (УКЖЛ).

Результаты исследований внедрены в учебный процесс ГОУ ВПО ПГФА кафедры промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии (акт внедрения от 18 апреля 2008 г.).

На защиту выносятся результаты экспериментального и теоретического обоснования технологии и стандартизации мягких лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Межрегиональной научно-практической конференции «Экспериментальные и клинические исследования новых лекарственных средств», посвященной 85-летию со дня рождения А.С. Саратикова (Томск, 2006); на второй российско-китайской Международной конференции по фармакологии (Пермь, 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на четвертом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные аспекты» (Санкт-Петербург, 2007); Региональной конференции ■молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии» (Екатеринбург — Пермь, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященной 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» (Пермь, 2008)

Автор выражает благодарность сотрудникам отделения препаратов бактериотерапии Пермского филиала НПО «Биомед» канд. мед. наук Чисто-хиной Л.П., а также д. мед. наук Маслову Ю.Н. (ПГМА) за содействие в проведении микробиологических исследований; д. хим. наук Чекрышкину Ю.С. •и канд. тех. наук Якушеву P.M. (Институт УРО РАН технической химии) за помощь в проведении реологических исследований и определении состава органических кислот УКЖЛ; д. фарм. наук Петриченко В.М. за оказание помощи в изучении аминокислотного состава УКЖЛ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БАД - биологически активная добавка ГОСТ — государственный стандарт качества ГФ - государственная фармакопея ЖКТ — желудочно-кишечный тракт ЛЖК — летучие жирные кислоты МГД — моноглицериды дистиллированные МЛФ — мягкая лекарственная форма Мм - молекулярная масса

МПК — минимальная подавляющая концентрация СОЖ — смазочно-охлаждающая жидкость ТУ - технические условия

УКЖЛ - ультрафильтрат культуральной жидкости лактобактерий

ФС — фармакопейная статья

ФСП — фармакопейная статья предприятия

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Разработка технологии и стандартизация лекарственных форм препарата на основе метаболитов лактобактерий"

Общие выводы

1. Получены экспериментальные серии нативного УКЖЛ, установлены оптимальные параметры концентрирования: температура 90 °С и разрежение 0,04-0,05 МПА.

2. Проведено сравнительное изучение физико-химических характеристик исходного и концентрированного УКЖЛ. Установлено, что при концентрировании кислотность возрастает в пределах от 15 до 19 раз. Значения плотности увеличиваются в 1,1- 1,2 раза. рН всех серий концентрированного УКЖЛ по сравнению с нативным УКЖЛ остаются неизменными, что свидетельствует о сохранении буферных свойств, растворов при сгущении. Определено содержание низкомолекулярных пептидов, общего азота, а также качественный и количественный состав органических и аминокислот. Все действующие вещества сохраняются при концентрировании и их количество увеличивается пропорционально степени сгущения.

3. Микробиологическими исследованиями подтверждена пробиотиче-ская активность в отношении Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ и Lactobacillus acidophilus КЗШ24 исходного и концентрированного УКЖЛ. Установлено, что к действию концентрированного УКЖЛ чувствительны как грамположи-тельные, так и грамотрицательные микроорганизмы. Показана возможность совместного применения концентрированного УКЖЛ при антибиотикотера-пии.

4. В ходе оптимизации по плану греко-латинского квадрата и реологических исследований определен оптимальный состав суппозиториев вагинальных с концентратом УКЖЛ. Установлено, что на высвобождение молочной кислоты , влияют вид эмульгатора и способ его введения, а на термостабильность - вид суппозиторной основы. Наибольшее высвобождение молочной кислоты наблюдали при использовании эмульгатора Т-2 и введении его в водную и липофильную фазу.

5. Разработана технологическая схема производства суппозиториев и проведена стандартизация (составлена спецификация), а также определен срок годности лекарственной формы (срок наблюдения) - 1 год.

6. Показана возможность использования концентрированного УКЖЛ в составе мази защитного действия.

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2009 года, Сорокина, Юлия Васильевна

1. Авдеев, В.Г. Пробиотики и пребиотики в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта / В.Г. Авдеев // Клин, фармакология и терапия. -2006.-№ 1.-С. 36-40.

2. Альберт, А. Константы ионизации кислот и оснований / А. Альберт, Е. Сержент. -М. : Химия, 1964. 180 с.

3. Андреева, И.В. Доказательства обоснованности профилактического применения пробиотиков / И.В. Андреева // Фарматека. 2006. - № 6. - С. 5661.

4. Аркуша, А.А. Исследование структурно-механических свойств мазей с целью определения оптимума консистенции: автореф. дис. . канд. фарм. наук / А.А. Аркуша. Харьков, 1982. - 18 с.

5. Барышников, Е.Н. Запоры в практике гастроэнтеролога / Е.Н. Барышников, В.Г. Румянцев // Consilium medicum. 2007. - Т. 9, № 7. - С. 38-43.

6. Белобородова, Н.В. Метаболиты анаэробных бактерий (летучие жирные кислоты) и реактивность макроорганизма / Н.В. Белобородова, С.М. Бе-лобородов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. - Т. 45, № 2. - С. 28-35.

7. Блинкова, Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л.П. Блинкова // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2003. - № 3. - С. 109-113.

8. Бондаренко, В.М. Иммуностимулирующее действие лактобактерий, используемых в качестве основы препаратов пробиотиков / В.М. Бондаренко, Э.И. Рубакова, В.А. Лаврова // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 1998. - № 5. - С. 107-112.

9. Бондаренко, В.М. Метаболитные пробиотики: механизмы терапевтического эффекта при микроэкологических нарушениях / В.М. Бондаренко // Consilium medicum. 2005. - Т. 7, № 6. - С. 437-443.

10. Бондаренко, В.М. Поликомпонентные пробиотики: механизм действия и терапевтический эффект при дисбиозах кишечника / В.М. Бондаренко // Фарматека. 2005. - № 20. - С. 46-54.

11. Бондаренко, В.М. По поводу нового подхода к классификации фармакопейных лекарственных пробиотических препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания / В.М. Бондаренко // Фарматека. 2007. - № 2. - С. 62-64.

12. Бондаренко, В.М. Пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбиозов / В.М. Бондаренко, Н.М. Грачева // Фарматека. 2003. - № 7. - С. 56-63.

13. Бондаренко, В.М. Стабилизирующее действие метаболитного про-биотика Хилак форте на нормальную микрофлору кишечника / В.М. Бондаренко // Фарматека. 2005. - № 1. - С. 36-43.

14. Бухарин, О.В. Межбактериальные взаимодействия / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцев, JI.M. Хуснутдинова // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2003. - № 4. - С. 3-8.

15. Вахитов, Т.Я. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты / Т.Я. Вахитов, JT.H. Петров, В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2005. - № 5. - С. 108-114.

16. Влияние препарата Хилак форте и его комбинации с антибиотиками на слизистую оболочку толстой кишки, ее контаминацию кампилобактерия-ми и криптоспоридиями / И.Т. Щербаков, Н.М. Грачева, Н.И. Леонтьева и др. // Фарматека. 2006. - № 6. - С. 101-105.

17. Влияние пробиотических энтерококков на рост Streptococcus agalac-tiae / Е.И. Ермоленко, А.Ю. Черныш, И.В. Марцинковская, А.Н. Суворов // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2007. - № 5. - С. 7377.

18. Воробьев, А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 1999. - № 6. - С. 102-105.

19. Воробьева, Л.И. Антимутагенные свойства бактерий (обзор) / Л.И. Воробьева, С.К. Абилев // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. - Т. 8, №2.-С. 115-127.

20. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых бактерий термокислотным способом / М.В. Гаврилин, Г.В. Сеньчукова, С.П. Сенченко и др. // Хим.- фарм. журн. 2007. - Т. 41, № 2. - С. 54-56.

21. Гинекология: национальное руководство / под ред. В.И.Кулакова, И.Б. Манухина, Г.М. Савельевой. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 1072 с.

22. Гинцбург, А.Л. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий / А.Л. Гинцбург, Т.С. Ильина, Ю.М. Романова // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2002. - № 5. - С. 86-93.

23. Государственный реестр лекарственных средств. Т. II (по состоянию на 1 января 2006 г.) : официальное издание. Минздрав РФ, 2006. — 1472 с.

24. Государственная Фармакопея XI: Вып. 1 Общие методы анализа. -М. : Медицина, 1987. 333 с.

25. Грачева, Н.М. Метаболические антибиотики: перспективы применения в клинике / Н.М. Грачева, О.С. Партии // Фарматека. 2007. - № 20. - С. 36-39.

26. Действие препарата аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 (Актофлор) на рост чистых и'смешанных культур бактерий / Т.Я. Вахитов, О.Ю. Яшина, JI.H. Петров, А.М.Королюк // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2000. - № 3. - С. 20-24.

27. Доль, М. Пробиотики и их значение для организма / М. Доль // Биол. медицина. 2007. - № 1. - С. 11-14.

28. Дроздова, И.Л. Аминокислоты фиалки полевой и донника рослого / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Фармация. 2003. - № 5. - С. 14-15.

29. Егоров, Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - Т. 44, № 6. - С. 33-40.

30. Зрячкин, Н.И. Новый подход к классификации пребиотиков, про-биотиков и синбиотиков / Н.И. Зрячкин // Фарматека. 2007. - № 2. - С. 58-61.

31. Изучение состава препарата, полученного на основе гидролизатов молочнокислых бактерий / В.А. Самойлов, Н.М. Гостищева, Г.В. Сеньчукова и др. // Хим.- фарм. журн. 2005. - Т. 39, № 3. - С. 51-52.

32. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, В.В. Поспелова; под ред. Г.Г. Онищенко, В.А. Алешкина, С.С. Афанасьева, В.В. Поспеловой. М. : ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

33. Инструкция по освоению системы обработки данных Aqilent Chem-Station Фирма Aqilent Technologies / Каталожный номер G 2070-91115. Редакция: 06/03. Документ издан в Германии. 211 с.

34. Исследование антибактериального действия Канефрона Н / Н.И. Аверьянова, В.В. Козлова, П.В. Косарева и др. // Фармация. 2007. - № 1. -С. 41-44.

35. К вопросу концентрирования бактериальных суспензий в производстве препаратов для бактериотерапии / В.А. Несчисляев, С.В. Логинов, Д.А. Харченко, Н.Б. Кравцова // Эксперим. и прикл. иммунология: тез. докл. на-учн. конф. Пермь, 1991. - С. 22.

36. Калинина, Е.В. Дисбиоз: современные возможности коррекции / Е.В. Калина // Аптеч. бизнес. 2006. - № 9. - С. 40-42.

37. Калмыкова, А.И. Пробиотики: Терапия и профилактика заболеваний. Укрепление здоровья / А.И. Калмыкова. Новосибирск, 2001. - 208 с.

38. Каширская, Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская // Рус. мед. журн. 2000. — Т. 8, № 13.-С . 572-575.

39. Квасников, Е.И. Молочнокислые бактерии и пути их использования /Е.И. Квасников, О.А. Нестеренко. М. : Наука, 1975. - 384с.

40. Комплексное применение препарата «Хилак форте» и антибиотиков и их действие на микрофлору кишечника / Н.М. Грачева, А.А. Аваков, А.Ф. Гаврилов и др. // Новые лекарств, препараты : экспресс-информ. 2006. -Вып. 1. - С. 15-23.

41. Конев, Ю.В. Болезни кишечника. Дисбиозы и их коррекция / Ю.В. Конев // Consilium medicum. 2005. - Т. 7, № 6. - С. 432-437.

42. Конев, Ю.В. Нарушение микробиоценоза кишечника и его лечение / Ю.В. Конев // Справ, поликлин, врача. 2007. - № 7. - С. 34-38.

43. Конь, И.Я. Пробиотические и кисломолочные продукты в питании детей раннего возраста / И.Я. Конь // Лечащий врач. 2007. - № 1. - С. 8-12.

44. Курепина, Н.Е. Микроцины: природа и генетическое детерминирование / Н.Е. Курепина, И.А. Хмель // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1986. - № 4. - С. 3-9.

45. Лобзин, Ю.В. Дисбактериоз, или полезны ли антибиотики / Ю.В. Лобзин, С.М. Захаренко, К.П. Плотников. СПб. : Спец. Лит, 2002. - 190 с.

46. Мавзютов, А.Р. Бактериальный вагиноз: этиопатогенетические аспекты / А.Р. Мавзютов, К.Р. Бондаренко, В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2007. - № 6. - С. 93-99.

47. Мази на основе жидких бактериальных культур и культуральных жидкостей лактобацилл / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев, И.В. Фадеева, Л.П. Чистохина // Человек и лекарство: тез. докл. VII Рос. нац. конгр. М., 2000.-С. 616.

48. Малкоч, А.В. Значение пребиотиков для функционирования кишечной микрофлоры / А.В. Малкоч, С.В. Бельмер, Т.В. Гасилина // Рус. мед. журн. -2008.-Т. 16, №3.-С. 151-153.

49. Малов, В.А. Микробиоценоз желудочно-кишечного тракта: современное состояние проблемы / В.А. Малов, Н.М. Гюлазян // Лечащий врач. -2007.-№ 6.-С. 10-13.

50. Маянский, А.Н. Микробиология для врачей (очерки патогенетической микробиологии) / А.Н. Маянский. Н. Новгород. : Изд-во Нижегород. гос. мед. акад., 1999. - 400 с.

51. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: в 2т. / М.Д. Машков-ский. М. : Новая Волна, 2001. - Т. 2. - 608 с.

52. Метаболиты Bacillus subtilis как новые перспективные пробиотиче-ские препараты / М.Ю. Волков, Е.И. Ткаченко, Е.В. Воробейчиков, А.В. Синица // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2007. - № 2. -С. 75-79.

53. Микробная экология влагалища / Л.И. Кафарская, О.В. Коршунова, Б.А. Ефимов и др. // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. -2002.-№6.-С. 91-99.

54. Минушкин, О.Н. Дисбактериоз кишечника: современное состояние проблемы / О.Н. Минушкин // Consilium medicum. 2007. — Т. 9, № 67. - С. 59-64.

55. Митрохин, С.Д. Дисбактериоз: современные представления. Диагностика возможности лечения / С.Д. Митрохин // Антибиотики и химиотерапия. -2004. Т. 49, № 7. - С. 23-33.

56. Молекулярные основы продукции и действия бактериоцинов / Л.П. Блинкова, М.Л. Альтшулер, Е.С. Дорофеева, О.Б. Горобец // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2007. - № 2. - С. 97-103.

57. Молохова, Е.И. Выбор состава и оценка качества мазевой композиции с лактобациллами / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев // Фармация в XXI веке: инновации и традиции: тез. докл. междунар. науч. конф. СПб., 1999. -С. 64.

58. Молохова, Е.И. Лекарственные препараты в терапии бактериального вагиноза / Е.И. Молохова, В.Н. Тарасевич, Л.П. Чистохина // Фармация. -2000. № 2. - С. 21-22.

59. Молохова, Е.И. Новые мазевые основы на базе культуральных жидкостей лактобацилл / Е.И. Молохова, Л.П. Чистохина, В.А. Несчисляев // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции : материалы конф. Пятигорск, 2003. - С. 139-141.

60. Молохова, Е.И. Разработка состава суппозиториев с лактобактери-ном / Е.И. Молохова, В.Н. Тарасевич, В.А. Несчисляев // Фармация. 1994. -№2.-С. 28-30.

61. Молохова, Е.И. Экспериментально-теоретическое обоснование составов, технологии и стандартизация лекарственных форм биопрепаратов : дис. . д-ра. фарм. наук / Е.И. Молохова. — Пермь, 2003. 396с.

62. Муравьев, И.А. Исследования реологических свойств гидрофильных мазей глицирама / И.А. Муравьев, Т.Ю. Манджиголадзе // Фармация. -1997. -№ 1.-С.15-17.

63. Мухина, Ю.Г. Иммунная система и микрофлора кишечника у детей. Обоснование функционального питания / Ю.Г. Мухина, М.И. Дубровская, Л.И. Кафарская // Фарматека. 2006. - № 2. - С. 22-27.

64. Назарова, Е.К. Микробиоценоз влагалища и его нарушения. Этиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика / Е.К. Назарова, Е.И. Гиммельфарб, Л.Г. Созаева // Антибиотики и химиотерапия. — 2002. Т. 47, № 4. - С. 34-42.

65. Несчисляев, В.А. Новый пробиотический препарат «Микростим» /

66. B.А. Несчисляев, Г.М. Сафонова, Л.П. Чистохина // Пробиотические организмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: материалы междунар. науч. практ. конф. - М., 2002. - С. 49.

67. Несчисляев, В.А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: дис. д-ра. мед. наук / В.А. Несчисляев. Пермь, 2005. - 277 с.

68. Несчисляев, В.А. Технологические перспективы в производстве препаратов для бактериотерапии / В.А. Несчисляев, Н.Б. Кравцова // Актуальные вопросы медицинской биотехнологии: материалы науч. конф. — Томск, 1991.-С. 133-134.

69. Нижевич, А.А. Пробиотики в лечении острых инфекционных диарей у детей: проблемы и перспективы / А.А. Нижевич, В.Р. Амирова // Урал, мед. журн. 2006. -№ 5. - С. 13-17.

70. Парфенов, А.А. Аминокислоты травы пустырника пятилопастного / А.А. Парфенов, Н.С. Фурса // Фармация. 2007. - № 7. - С. 6-7.

71. Пастухова, В.А. Эффективность Хилак форте при коррекции микроэкологических нарушений в кишечнике у детей с атопическими дерматитами / В.А. Пастухова, О.В. Зайцева, М.Д. Ардатская // Фарматека. 2007. - № 6.1. C. 78-82.

72. Перспективные разработки по созданию новых лекарственных форм препаратов бактериотерапии / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев, Г.А. Панкратова и др. // Современная вакцинология : тез. докл. II междунар. конф.-Пермь, 1998.-С. 146-147.

73. Поздеев, O.K. Медицинская микробиология / O.K. Поздеев; под ред. В.И. Покровского. 3-е изд., стереотип. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005. - 768 с.

74. Потапов, А.С. Применение пробиотиков врачами общей практики / А.С. Потапов, Н.Л. Пахомовская, С.И. Полякова // Справ, поликлин, врача. -2007. № 6. - С. 45-49.

75. Потенциометрическое определение констант диссоциации мезато-на и адреналина / С.И. Карпов, М.В. Матвеева, В.Ф. Селеменев и др. // Хим.- фарм. журн. 2005. - Т. 39, № 12. - С. 47-50.

76. Потенциометрическое титрование в анализе водных извлечений / Н.Н. Федоровский, А.И. Марахова, А.А. Сорокина, О.В. Ольшанская // Фармация. 2008. - № 2. - С. 15-16.

77. Прилепская, В.Н. Нарушение микробиоценоза влагалища, пути его коррекции / В.Н. Прилепская, Г.Р. Байрамова // Гинекология. 2007. - Т. 9, № 4. - С. 25-27.

78. Пробиотики в коррекции дисбиозов // Урал. мед. журн. 2005. - № 6.-С. 55-56.

79. Проблемы создания лекарственных форм препаратов лакто- и би-фидобактерий / Е.И. Молохова, В.А. Несчисляев, B.C. Пучнин и др. // Человек и лекарство: тез. докл. II Рос. нац. конгр. М., 1995. - С. 321.

80. Радзинский, В.Е. Роль Actimel в восстановлении нарушенного микробиоценоза половых органов беременных / В.Е. Радзинский, И.М. Ордиянц // Фарматека. 2006. - № 2. - С. 62-65.

81. Разветвленные антимикробные пептиды / А.Ю. Хрущев, А.И. Каш-паров, JI.B. Клименко, Ю.В. Митин // Биоорг. химия. 2007. - Т. 33, № 6. - С. 588-592.

82. Реологические свойства мазей с полиненасыщенными жирными кислотами микробиологического происхождения / И.В. Кутузова, Ю.В. Степанов, Н.К. Бабанова, А.И. Тенцова // Фармация. 1991. - № 2. - С. 30-35.

83. Роль биологических свойств вагинальных лактобацилл в процессах колонизации / С.В. Черкасов, Т.М. Забирова, А.В. Сгибнев, И.В. Черкасов // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2003. - № 4. — С. 6164.

84. Ручкина, И.Н. Место пробиотиков в концепции функционального питания / И.Н. Ручкина, Д.В. Усенко // Consilium medicum. 2007. - Т. 9, № 7. - С. 54-58.

85. Савицкая, И.С. Подавление мутагенной активности метаболитов кишечника при нормобиоцеозе / И.С. Савицкая, В.М. Бондаренко // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2008. - № 3. - С. 53-58.

86. Санитарно-микробиологический контроль в пищевой и фармацевтической промышленности / В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, К.А. Каграманова и др. СПб., 2004. - 248с.

87. Северьянова, JI.A. Современные представления о действии аминокислоты L-лизина на нервную и иммунную регуляторные системы / Л.А. Северьянова, М.Е. Долгинцев // Человек и его здоровье. 2007. - № 2. - С. 6779.

88. Сенченко, С.П. Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий: автореф. дис. . канд. фарм. наук. / С.П. Сенченко. Пятигорск, 2006. — 24 с.

89. Серова, Г. Одна капсула и миллионы полезных бактерий / Г. Серова // Фарм. ведомости. 2002. - № 11. - С. 25-27.

90. Скворцов, В.В. Дисбиоз кишечника и антибиотик-ассоциированная диарея, диагностика и лечение / В.В. Скворцов // Лечащий врач. 2008. - № 2. - С. 43-47.

91. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 / Т.Я. Вахитов, Е.Н. Момот, О.Н. Шалаева, Л.Н. Петров // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 2003. - № 6. - С. 20-25.

92. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М.О. Биргера. М. : Медицина, 1982. -464 с.

93. Татюник, В.Л. Патогенез, диагностика и методы лечения бактериального вагиноза / В.Л. Татюник // Фарматека. 2005. - № 2. - С. 20-24.

94. Титова, А.В. Изучение антибактериального действия низкомолекулярного поликатионного пептида варнерина на антибиотикорезистентныештаммы Staphylococcus epidermidis.: автореф. дис. .канд. биол. наук / А.В. Титова. Пермь, 2002. — 23 с.

95. Топчий, Н.В. Проблема дисбиоза в общей семейной (врачебной) практике / Н.В. Топчий // Фарматека. 2007. - № 8-9. - С. 46-52.

96. Топчий, Н.В. Проблема дисбиоза и здоровье семьи / Н.В. Топчий // Фарматека. 2007. - № 20. - С. 59-66.

97. Урсова, Н.И. Хилак форте: новое направление в коррекции дис-бактериоза кишечника у детей / Н.И. Урсова, Г.В. Римарчук, К.И. Савицкая // Фарматека. 2005. - № 2. - С. 25-29.

98. Урсова, Н.И. Пробиотики в комплексной коррекции дисбактериоза кишечника у детей / Н.И. Урсова // Лечащий врач. 2008. - № 1. - С. 12-13.

99. Усенко, Д.В. Возможности использования пробиотического продукта Actimel в педиатрии / Д.В. Усенко, А.В. Горелов // Фарматека. 2006. -№ 5.- С. 83-87.

100. Фармацевтическая микробиология / В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец и др. М. : Арнебия, 2003. - 352 с.

101. Фиев, Д.Н. Применение бактериального экстракта Escherichia coli Уро-Ваксома© в лечении и профилактике неосложненной инфекции мочевых путей / Д.Н. Фиев, А.З. Винарсв // Фарматека. 2006. - № 10. - С. 15-18.

102. ФС 42-3874-99 Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля иммунобиологических препаратов. 23 с.

103. ФСП 42-05047298054 Лактобактерин сухой / Введ. 13.10.06. до 13.10.11.-15 с.

104. Хамм, М. Основы здорового питания / М. Хамм, Б. Лангер // Биол. медицина. 2007. - № 2. - С. 60-63.

105. Хайгер, Д. Высокоэффективный капиллярный электрофорез. Введение № документа: 5968-9963 Е. март 2000г. : перевод с англ. Б.П. Лапина. -115 с.

106. Чистохина, Л.П. Иммунобиологическая характеристика препарата «Микростим» на основе метаболитов лактобактерий: дис. . канд. мед. наук / Л.П. Чистохина. Пермь, 2004. - 171 с.

107. Шаршунова, М. Токослойная хроматография в фармации и клинической биохимии в двух частях / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. М. : Мир, 1980.-629 с.

108. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 2 т. Т. I. : Микрофлора человека и животных и ее функции. / Б.А. Шендеров. М. : ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

109. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 2 т. Т. II. : Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. / Б.А. Ше-недеров. М. : ГРАНТЪ, 1998. - 416 с.

110. Цагарейшвили, Г.В. Биофармацевтические, фармакокинетические и технологические аспекты создания мягких лекарственных форм: ректальные препараты / Г.В. Цагарейшвили, В.А. Головкин, Т.А. Грошовый. Тбилиси. : «Мецниереба», 1987. - 263 с.

111. Anderson, R. The significance and potential molecular mechanism of gastrointestinal barrier homeostasis / R. Anderson // Scand. J. Gastroenterol. -1997.-Vol. 32, № l.-P. 1073-1083.

112. Antihypertensive effect of extract of Lactobacillus casei in patients with hypertension / K. Nacajima et al. // J. Clin. Biochem. Nutr. 1995. - Vol. 18. -P. 181-187.

113. Bogovic, M.B. Bacteriocinogenic activity of Lactobacilli isolated from cheese and baaby faeces / M.B. Bogovic, I.Rogelj // Food Technol. And Biotech-nol. 1999. - № 2. - P. 93-100.

114. Borriello, S.P. Microbial flora of the gastrointestinal tract / S.P. Bor-riello // Microbial metabolism in the difestive tract / Ed. M.J. Hill.- New York, 1986.-P. 3-15.

115. Brock, T.D. Biology of Microorganism. / Ed.M.T. Madigan, J.N. Mar-tinko, J. Parker. London: Prentice Hall Internacional, 1997. - 997 p.

116. Castellano, P. Mode of action of lactocin 705, a two- component bacte-riocin from Lactobacillus casei CRL 705 / P. Castellano, R.Raya, G. Vignolo // Intern. J. Food Microbiol. 2003. Vol. 85, № 1-2. - P. 35-43.

117. Complementary and overlapping selectity of the two-peptide bacterio-cins plantaricin EF and JK / G.N. Moll et al. // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. -P. 4848-4852.

118. Cross, M.L. Anti-allergy properties of fermented foods : am important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria ? / M.L. Cross, L.M. Stevenson, H.L. Gill // Intern. J. Immunopharmacol. 2001. - Vol. 1, № 5. - P. 891-901.

119. Diep, D.B. A bacteriocin — like peptide induces bacteriocin synthesis in Lactobacillus plantarum Cll / D.B. Diep, L.S. Havarstein, I.F. Nes // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 18 - P. 631-639.

120. Garneau, S. Two-peptide bacteriocins produced by lactic acid bacteria / S. Garneau, N.I. Martin, J. C. Vederas // Biochim. 2002. - Vol.84, № 5-6. - P. 577-592.

121. Grunewald, К. K. Serum cholesterol levels in rats fed fermented by Lactobacillus acidophilus / K.K. Grunewald // J. Food Sci. 1982. - Vol. 47. - P. 153-157.

122. Havell, E.A. The role of the flora in cytokine responses / E.A. Hav-ell // Microb. Ecol. Health and Disease. 1999. - № 2. - P. 104.

123. Lantibiotics : biosintesis, mode of action and applicacions / C. Van Kraaij et al. //Natur. Prod. Repts. 1999. - Vol. 16, № 5. - P. 575-587.

124. Lidbeck, A. Lactobacilli, anticarcinogenic activites and human intes-tinalal microflora / A. Lidbeck // Eur. J. Cancer. Prew. 1992. - Vol. 1, № 5. - P. 341-353.

125. MacFarlane, G.T. Human colonic microbiota : ecology, physiology and metabolic protential of intestinal bacteria / G.T. MacFarlane, S. MacFarlane // Scand. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 32, Suppl. 222. - P. 3-10.

126. Malolepsza-Jarmolowska, K. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations. Part 3: Effects of the properties of methylcellulose gels / K. Malolepsza-Jarmolowska, A.A. Kubis // Pharmazie 2000. 55, № 8. - P. 160162.

127. Matzusaki T. Modulating immune responses with probiotic bacteria / T. Matzusaki, J. Chin // Immunol, and Cell. Biol. 2000. - Vol. 78, № 1. - p. 67-73.

128. Messens, W. Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from sourdoughs a review / W. Messens, L.D. Vuyst // Intern. J. Food Microbiol. 2002. - Vol. 72, № 1-2. - P. 31-43.

129. Mode of action, purification and amino acid sequense of plantaricin С19, an anti-Listeria bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum C19 / A. Atrin et al. // Intern. J. Food Microbiol. 2001. - Vol. 68. - P. 93-104.

130. Patent 5929109 USA, A61 K39/02, A61 К 45/00. Enhancing and stabilizing agent of the activity of Bifidus factor / M. Hiroharu, I. Kakuhai, K. Tsu-tomu. Filed dates 03.10.97; issued dates 27.07.99.

131. Patton, G.C. New developments in lantibiotic biosynthesis and mode of action / G.C. Patton, W.A. van der Donk // Curr. Opin. Micribiol. 2005, Vol. 8 -P. 543-551.

132. Sablon, E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis / E. Sablon, B. Contreras, E. Vandamme // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2000. - Vol. 68. - P. 21-60.

133. Salminem, S. Gut flora in normal and disorderd states / S. Salminen, E. Isolauri, T.Onella // Chemother. 1995. - Vol. 41. - P. 5-15.

134. Sutter, V.L. Anaerobes as normal oral flora / V.L. Sutter // Rev. Infect. Dis. 1984. - Vol. 6, Suppl. 1. - P. 16-24.