Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение сырья и путей получения кардиотонических гликозидов из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh

Автореферат отсутствует в библиотеке
АВТОРЕФЕРАТ
Изучение сырья и путей получения кардиотонических гликозидов из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh - диссертация, тема по фармакологии
ДИССЕРТАЦИЯ
Бокарева, Светлана Юрьевна Москва 2003 г.
Ученая степень
кандидат фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Оглавление диссертации Бокарева, Светлана Юрьевна :: 2003 :: Москва

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общие сведения о сердечных гликозидах, их строение и классификация.

1.2. Методы получения сердечных гликозидов.

1.2.1. Введение.

1.2.2. Ферментация листьев наперстянки шерстистой.

1.2.3. Головная экстракция сырья.

1.2.4. Выделение гликозидной фракции.

1.2.5. Разделение смеси гликозидов.

1.2.6. Очистка технического продукта.

1.3. Методы анализа сердечных гликозидов.

1.3.1. Введение.

1.3.2. Предварительная очистка.

1.3.3. Физико- химические методы определения сердечных гликозидов.

1.3.4. Химические методы определения сердечных гликозидов.

1.3.4.1. Методы определения сердечных гликозидов наперстянки по углеводному фрагменту.

1.3.4.2. Методы определения сердечных гликозидов наперстянки по стероидной части.

1.3.4.3. Методы определения сердечных гликозидов наперстянки по лактонному кольцу.

1.3.5. Хроматографические методы.

1.3.5.1. Колоночная хроматография.

1.3.5.2. Бумажная хроматография.

1.3.5.3. Тонкослойная хроматография.

1.3.5.4. Газожидкостная хроматография.

1.3.5.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

 
 

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Бокарева, Светлана Юрьевна, автореферат

Актуальность темы. В последнее время заболевания, связанные с нарушением сердечно-сосудистой деятельности получают все большее распространение среди людей зрелого возраста. Причинами являются сложная экологическая обстановка, постоянные стрессы, а также многие факторы окружающей среды. В связи с этим важность лекарств, оказывающих кардиотоническое воздействие на сердечную мышцу трудно переоценить.

Среди основных лекарственных средств, оказывающих избирательное кардиотоническое действие и применяемых для лечения сердечной недостаточности, издавна были представлены суммарные препараты из растений семейства норичковых (Scrophulariaceae), содержащих сердечные гликозиды, и выделенные из этих растений индивидуальные гликозиды.

Наиболее эффективными из них признаны индивидуальные гликозиды из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh., такие как ланатозид С (целанид) и дигоксин.

В настоящее время из наперстянки шерстистой в России на основе ланатозида С выпускается препарат целанид (в различных лекарственных формах). Кроме того, на фармацевтическом рынке имеется дигоксин, который отличается от ланатозида С отсутствием глюкозы и ацетильной группы, и стал сейчас наиболее популярным у потребителей.

Сегодня российский рынок наполнен препаратами из наперстянки шерстистой зарубежных фирм: «Ciech-Polfa Group» (Чехия-Польша), «Gedeon Richter» (Венгрия), «Опоп» (Финляндия), «Nicomed» (Дания), «Таллиннский фармацевтический завод» (Эстония), «Teva» (Израиль), «Pliva» (Хорватия), «Glaxo Wellkome» (Великобритания), «Eii Lilly» (Швейцария)

Единственным отечественным производителем целанида является ВИЛАР РАСХН.

В настоящее время известны и хорошо освоены для получения субстанции целанида методы выделения сердечного гликозида из растительного сырья. Однако выделение ланатозида С все еще связано с рядом проблем, по этой причине работа по совершенствованию технологии остается актуальной.

Не менее важной проблемой является также и отработка оптимальных условий для получения дигоксина - продукта ферментативной деградации ланатозида С.

В связи с потребностями технологии переработки необходимо иметь информацию об активности в сырье ферментов, способных трансформировать первичные гликозиды во вторичные и, исходя из этого, определять пути его переработки.

В последнее время большинство специалистов в области кардиологии рекомендуют отказаться от использования ланатозида С в пользу дигоксина. С точки зрения технологии выделения данных веществ из растительного сырья предпочтение также отдается дигоксину.

Цель и задачи исследования. На основе углубленного фитохимического исследования сырья наперстянки шерстистой оптимизировать процесс выделения первичных гликозидов (абицина) и разработать технологию получения вторичного гликозида - дигоксина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Провести изучение и анализ исходного сырья - наперстянки шерстистой (Digitalis lanata Ehrh.) с различными условиями заготовки с целью определения его пригодности для переработки на дигоксин или целанид.

Отработать методы качественного количественного анализа сырья, получаемых продуктов и постадийного контроля.

Оптимизировать процессы выделения суммы первичных гликозидов наперстянки (ланатозидов А, В и С).

Разработать технологию получения вторичных гликозидов наперстянки с ориентацией на дигоксин и осуществить ее масштабирование.

Исследовать полученные продукты и содержащиеся в них примеси, выявить причины их появления и пути утилизации.

Научная новизна. Сырье наперстянки шерстистой исследовано на предмет активности содержащихся в нем нативных ферментов с использованием хроматографических методов, в результате чего предложен принцип оценки его качества с целью определения способа его переработки.

Усовершенствовано выделение первичных гликозидов из наперстянки шерстистой до стадии получения абицина (суммы ланатозидов А, В и С), предложены варианты дальнейшего разделения ланатозидов и разработана новая методика получения вторичного гликозида наперстянки - дигоксина.

Теоретически и экспериментально обосновано применение в разработанных способах получения сердечных гликозидов новых методов, таких как использование альтернативных экстрагентов, растворителей для выделения и очистки, современных хроматографических методов, перекристаллизации, объяснена их роль для обеспечения оптимального проведения процесса.

Разработана методика с использованием ТСХ для постадийного контроля производства целанида и дигоксина.

Методом сравнительного анализа 'Н-ЯМР-спектров, ВЭЖХ, ТСХ с образцами стандартов проведены идентификация конечных продуктов производства и их качественно-количественный анализ. На основании данных, полученных с использованием аналитических методов установлен характер примесей в конечных и промежуточных продуктах, установлены причины их присутствия.

Предложено применение физико-химических методов анализа для контроля технологического процесса.

Практическая значимость. Предложен принцип определения ферментативной активности в сырье наперстянки шерстистой. В лабораторных условиях усовершенствована методика получения абицина (суммы ланатозидов А,В и С), составлена методика для получения абицина в производственных условиях. Результаты проведенных исследований в виде разработанной технологии включены в патент РФ №2186069 от 20.06.2001 на «Способ получения технического дигоксина». Проведено масштабирование процесса получения дигоксина. Разработана технология получения дигоксина в производственных условиях и опробована в цехе фитохимии производственно-экспериментального завода ВИЛАР.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на II Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Казань, 2002 г.), на 6-ом Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт- Петербург, 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы и получен патент РФ.

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с Ф/П развития медицинской промышленности до 2005 г, приоритетным направлением ОМБН РАМН - «Создание современных перспективных лекарственных средств», планом НИР и ОКР ВИЛАР.

На защиту выносятся следующие положения.

- Способ оценки активности ферментов в сырье наперстянки шерстистой для выявления оптимального способа его переработки.

- Результаты исследований по совершенствованию выделения суммы ланатозидов А, В и С.

Результаты исследований по разработке технологии получения дигоксина.

- Результаты исследований по использованию физико-химических методов для идентификации целевых продуктов, определения характера примесей, причин их появления.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 5 схем и 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение сырья и путей получения кардиотонических гликозидов из наперстянки шерстистой Digitalis lanata Ehrh"

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. Предложен принцип определения активности ферментов в сырье различного происхождения, что позволяет оценить пригодность конкретного сырья для переработки на целанид или на дигоксин.

2. Показано, что при ферментативном гидролизе из ланатозида С сначала образуется ацетилпроизводное вторичного гликозида — ацетилдигоксин, которое при дальнейшем проведении процесса превращается в дигоксин.

3. Предложена 3-х стадийная схема выделения суммы ланатозидов А, В и С (абицина) из наперстянки шерстистой, осуществленная в крупнолабораторном масштабе, позволяющая в ходе производства оптимизировать расходные нормы сырья, растворителей и трудозатрат при улучшении качества целевого продукта и эффективности его выделения. Содержание ланатозида С в смеси составило 70- 80 % (в ранее предложенной технологии 60- 65 %).

4. Предложена оригинальная схема получения дигоксина в шесть стадий, которая была масштабирована до опытно-промышленных загрузок при сохранении показателей качества и выхода субстанции.

5. При совершенствовании технологии получения гликозидов наперстянки использованы преимущества «флеш» - техники при сорбционной очистке гликозидов, оптимизировано количество сорбента на данной стадии, а также разработаны удобные условия ТСХ и ВЭЖХ — контроля за ходом процесса выделения.

6. На стадии хроматографического разделения вторичных гликозидов выделены побочные вещества и охарактеризованы с помощью ТСХ, ВЭЖХ и 'Н-ЯМР-спектроскопии как продукты неполного ферментативного гидролиза — ацетилдигоксин и ацетилдигитоксин

1.3.6. Заключение.

Современные методы анализа сердечных гликозидов основаны на предварительном разделении и последующем количественном определении с помощью спектральных, либо хроматографических методов. Спектральные методы в видимой, ультрафиолетовой и инфракрасных областях спектра, обладая достаточной точностью не дают возможности однозначно идентифицировать вещество, установить его однокомпонентность, тогда как метод ЯМР- спектроскопии позволяет определять положения, характер и число функциональных групп. Среди хроматографических методов наиболее длительными и трудоёмкими являются методы колоночной и бумажной хроматографии, что обосновывает попытки исследователей заменить их на другие методы, такие как тонкослойная хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография. Тонкослойная хроматография обеспечивает высокую скорость разделения, возможность применения различных сорбентов и агрессивных реагентов в составе подвижных фаз и при проявлении хроматограмм. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами, такими как высокая чувствительность, быстрота и точность получаемых результатов, возможность определения индивидуальных гликозидов, содержащихся в смесях.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ СЫРЬЯ НАПЕРСТЯНКИ ШЕРСТИСТОЙ С ЦЕЛЬЮ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПУТИ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ.

При осуществлении предлагаемой в данной работе технологии принципиальным становится не только определение содержания ланатозида С в перерабатываемом сырье, но и оценка активности ферментных систем листа, сниженная высушиванием, уровня ее регенерации при замачивании.

На активность гидролаз (гликозидаз и эстераз) листа наперстянки, служащего сырьем для производства кардиотонических препаратов, должны оказывать влияние такие факторы как фаза вегетации, условия сбора, сушки и хранения, сроки хранения сырья.

Так, было проанализировано сырье наперстянки шерстистой урожаев 2000 (второй год вегетации) и 2001 (первый год вегетации) гг.

ТСХ- контроль за ходом ферментации показал, что через 24 часа процесс преврощения ланатозида С в дигоксин проходит полностью. Ланатозид С исчезает уже через 2 часа. В качестве продукта ферментативного превращения ланатозида С вначале образуется ацетилдигоксин, а затем дигоксин. Исходя из этого можно сделать предположение о том, что скорость действия гликозидаз выше, чем скорость действия эстераз. Т.о. процесс ферментативного превращения первичных гликозидов во вторичные проходит, главным образом, через стадию образования дезгликозилированных производных (схема 1).

На базе данных ТСХ-анализа, подтвержденных данными ВЭЖХ-анализа, проведенными совместно с Балакиной М. В., нами установлено, что скорость ферментативного гидролиза выше в сырье урожая 2001 г. Это связано или с тем, что срок хранения сырья урожая 2000 г больше, или с тем, что сушка его велась при более высокой температуре, или с тем, что активность ферментов у растения второго года вегетации существенно ниж

Если при переработке сырья на целанид желательно дезактивировать ферменты, подавить автоферментацию, то при получении дигоксина, напротив, на первой стадии недостаточная нативная активность гидролаз снижает полноту превращения ланатозида С в дигоксин, усложняет условия очистки за счет появления примесей, являющихся продуктами неполного гидролиза исходных первичных гликозидов листа — дезацетилированн ых и дезгликозилированных производных ланатозидов, в частности дезацетилланатозида С (продукт отщепления ацетильной группы) и ацетилдигоксина (продукт отщепления глюкозы) (схема 1).

Схема 1.

Переход ланатозида С в дигоксин под действием ферментативных систем.

Н Н Н нотЧ^уЗу-о н н

I снгон Н

Ланатозид С глякозндазы| эстеразы|

Ацетилдигоксин rSLl Н

Дезацетилланатозид С эстеразы) гликозидазы) он н

Дигоксин

Таким образом, в связи с потребностями технологии переработки необходимо иметь информацию об активности в сырье ферментов, способных трансформировать первичные гликозиды во вторичные.

Нами предложен принцип оценки ферментативной активности сырья наперстянки шерстистой с использованием ВЭЖХ-метода. Определение базируется на измерении концентрации ланатозида С в сырье через 15 минут после замачивания при соблюдении стандартных условий (температуры, начальной концентрации субстрата, условий пробоподготовки). Изменение концентрации, переведенное в число микромолей ланатозида С, гидролизуемых в этих условиях ферментами, присутствующими в 1 г сырья за 1 минуту, соответствует ферментативной активности, выраженной согласно ГФ XI, т.2, стр. 28 в Международных единицах активности (см. табл. 11)

В ходе работы с сырьем разного качества было показано, что активность ферментов, определенная таким способом, варьирует в довольно широких пределах (таблица 11).

 
 

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2003 года, Бокарева, Светлана Юрьевна

1. Аитова Р. 3., Масленникова В. А., Абубакиров Н. К. «Определение 2-дезоксиальдоз и их природных гликозидов с помощью ксантгидрола.» //Химия природн. соедин., №5, 1973, с. 641- 645

2. Бокарева С.Ю, Звонкова Е.Н., Либизова Л.Ф., Вечканова Л.Д., Быков В.А. "Способ получения технического дигоксина" //Патент РФ № 2186069, Москва, 2001.

3. Бокарева С.Ю., Либизова Л.Ф., Звонкова Е.Н., Вечканова Л.Д.,.Быков В.А. "Совершенствование технологии получения гликозидов из наперстянки шерстистой"//Сборник научных трудов 70 лет ВИЛАР "Химия, технология, медицина," Москва., 2000, с. 159-161.

4. Власенко Л. М., Рубцов А. Ф. «Извлечение дигоксина органическими растворителями»// Фармация, 23, №6, 1974, с.58-59.

5. Воробьев. А.И.".Нужно учиться жить и мыслить по-новому" //Ремедиум. №3, 1999, с. 8-14.

6. Генкина Г. Л., Абакумов Н. К., Шакиров Т. Т. «Методы определения сердечных гликозидов» //Ташкент, издательство «ФАН» УССР, 1985, 160 с.

7. Горбунов В. Д., Янковский Б. А., Рыжиков А. А. «Способ получения гликозидов из листьев напестянки шерстистой.» //Авторское свидетельство СССР №114428, Москва, 1983

8. Ю.Евстратова К. И., Аль-Хаддад И., Сташуленок В. К. «Изучение условий экстрагирования и хроматографического разделения стероидов на примере дигиланидов»//Журн. прикл. химии, 71, № 3, 1998, с. 381-386

9. КЕвстратова К. И, Сташуленок В. К. Хлебникова Л. А. «Разделение суммы дигиланидов А, В и С методом ТСХ и определение дигиланида С» //Хим,-фармацевт. журн., 22, №2, 1988, с.242- 247

10. Захаров В. П., Либизов Н. И., Асланов X. А., «Лекарственные вещества из растений и способы их производства» //Ташкент, издательство «ФАН» УССР, 1980 г., 260 с.

11. Карташов В. С., Шоршнев С. В., Арзамасцев А. П., Попов Д. М., «Спектроскопия ЯМР 1Н в анализе лекарственных средств. Идентификация сердечных гликозидов» //Фармация, 41, №3, 1992, с.26- 29

12. Конон Н. Т., Жученко А. А. мл. «Результаты и перспективы селекционно-семеноводческой работы с лекарственными растениями» //Сборник научных трудов 70 лет ВИЛАР "Лекарственное растениеводство," Москва., 2000, с.32- 42.

13. Мавлянова М. Б., Попов Д. М. «Использование хроматометрических методов для анализа препаратов наперстянки шерстистой при их хранении»//Хим.- фармацевт, журн., 20, № 11, 1985, с. 1377-1379

14. Мавлянова М. Б., Попов Д. М. «Хроматофотоколориметрическое определение целанида»// Химия природн соедин, №3, 1986, с.332- 336.

15. Макаревич И. Ф., Алистренко А. И., Бондарь Н. Я «Способ получения дигоксина.» //Авторское свидетельство СССР №1501341, Москва, 1987

16. Макаревич И. Ф., Губин Ю. И., Кисличенко С. Г. и др. «Способ получения суммы ланатозидов АВС.» //Авторское свидетельство № 1253005 Москва, 1984

17. Макаревич И. Ф., Дикань Л. Н., Алистренко А. И. «Способ очистки дигоксина.» //Авторское свидетельство № 1637081 Москва, 1989

18. Макаревич И. Ф.,Кисличенко С. Г. Клименко О. И. и др. «Способ получения кристаллической суммы ланатозидов АВС.» //Авторское свидетельство № 1095494 Москва, 1982

19. Макаревич I. Ф, ЧерняЕв Ю.А., Воробйов М.Е., €вс££ва Л.В, Ал1стренко A.I. «Про ферментний пдрол1з серцевих ппкозщцв у процеа екстракцп ix з рослинно! сировини спирто- водними розчинниками» // Фармацевтический журнал (Киев), №4, 1987, с. 71- 72.

20. Машковский М.Д. Лекарственные средства.//М.: Медицина, 1988, т. 1. 624 с.

21. Митченко Ф. А. «Спектрофотометрический метод количественного определения дигитоксина, гитоксина, целанида и дигоксина» //Фармацевт. журн.,№4, 1971, с.28-30.

22. Муравьева Д. А. «Фармакогнозия» // М: «Медицина» 1978, 650 с.25.0ПР №391037 на производство абицина и целанида. // Москва,

23. Минмедпром. Техническое управление ВПО «Союзмедсредства», 1980.26.0ПР №391051 на производство абицина и целанида. // Москва,

24. Минмедпром. Техническое управление ВПО «Союзмедсредства», 1982 г.

25. Попов Д. М., Мавлянова «Хромато- фотоколориметрическое определение дигоксина» //Химия природн. соедин. №1, 1985, с.66- 71.

26. Регистр лекарственных средств «Энциклопедия лекарств» (2000 г) 7-е издание, М: РЛС 2000

27. Сациперов Ф. А., Демьянец П. Р., Заболотная Е. С. «Наперстянка» //М: «Медгиз» 1954, 219 с.

28. Фетисов А. А., Раевский А. В., Гринкевич Н. И., «Количественное определение ланатозида С в листьях наперстянки шерстистой» //Хим,-фармацевт журн., 18, №5 ,1984, с.588-592.

29. Фетисов А. А., Раевский А. В., Гринкевич Н. И., Цыбулько Н. С. «Современные методы определения ланатозида С и дигоксина в листьях наперстянки шерстистой (Обзор)» //Хим.- фармацевт, журн., 18, № 11, 1984, с.1348-1356.

30. Физер J1., Физер М. «Стероиды» //М: «Мир» 1964, 982 с.

31. Шилов Ю. М., Королева М. Я. «Идентификация и определение сердечных гликозидов дигиталиса методом ИК- спектроскопии в сочетании с ТСХ»// Журн. аналит. химии, 32, №11, 1984, с.2055- 2957.

32. Шилов Ю. М., Королева М. Я., Вещиков В. В., «Сравнительная характеристика хроматоспектральных методов анализа сердечных гликозидов на примере ланатозидов А, В и С.», //Фармация, 34, №2, 1985, с.46-50.

33. Banek М., Michalak D., Wojtczak S., Tucholski К., Wyrzykowska В. "Sposob otrzymywania czystych lanatozydow А, В i С z ich mieszanin." //Патент ПНР № 141646, 1987

34. Britten A.Z., Njau E. "The specific fluorimetric determination of digoxin"// Anal, chim. acta", 76, №2, 1975, p. 409- 417.

35. Casalonca A." Procede d'extraction de glycosides hydrophiles de la Digitalis lanata." // Патент Франции № 1508234,1968

36. Cvak L., Elis Т., Prochazka V. et al. "Zpusob izolace digoxinu." // Авторское свидетельство ЧССР №233669, 1986

37. Dancsi L., Farcas J., Bata K. et al "Eljaras szivglukozidok, illetve aglukonjaik elvasztasara."//Патент ВНР № 178705,1983

38. Debska W., Saskowska A., " Metoda oznaczania zawartosci lanatosydu С w lisciach naperstnicy welnistej" //Herba Pol., 28 №3-4, 1982, s. 139- 144.

39. Dittrich F " Eljaras kristalyos digitalisglukozidok, ku lonosen A es С lanatozid eloallitasara." // Патент ВНР № 149426, 1959

40. Fujii Youichi, Ikeda Yukari, Okamoto Ihiro, Yamazaki Mitsuri "Separation and determination of lanatosides in Digitalis lanata leaves by high- performance liquid chromatography." //J. chromatogr, 508, 1990, p. 241-246

41. Fuska J., Proksa В., Khandlova A., Sturdikova M., "Microbiial transformation of cardioglycosides" // Appl. Microbial, biotechnol., 26, 1987, p. 313-317.

42. Fuska J., Proksa В., Khandlova A. "Sposob pripravi acetyldigoxinu." // Авторское свидетельство ЧССР № 254050, 1988.

43. Garratt W. P. and Stewart J.T. «High- performance thin-layer chromatographic determination of digoxin and related compounds, digoxigenin bisdigoxoside and gitoxin, in digoxin drug substance and tablets». //.J chromatogr. (A), 659, №1, 1994, p. 177-183

44. Haslinger E., Korhammer S., Schubert-Zsilavecz M„ "Sequential Analysis of Oligosaccharide Structures by Modem NMR Techniques" // Liebigs Ann. Chem., 1990, p. 713-714

45. Kaminski M., Sledzinska B. and Klawiter J. "Studied on the optimization of parameters of preparative liquid chromatography columns for production of cardiac glycosides." Hi. chromatography, 367, 1986, p. 45-58.

46. Kohlmay K.-H. "Verfahren zur Extraktion von herzwirksamen Glicoziden aus Digitalis lanata, bzw. Digitalis рифигеа".//Патент ГДР № 106369 ,1974

47. Kolarova H. et al. "Zpusob zpracovani digoxinu-type glycosiduz lanatosidu." // Авторское свидетельство ЧССР № 260703, 1989

48. Krzek J., Moniszewska M., "Densytometrycz na metoda oznaczania lanatosydu С w lekach recepturowych" // Farm. Pol., 40, №11, 1984, s. 655-656.

49. Langlume N."Procede de preparation de la digoxine" //Патент Франции №2552767, 1983

50. Milica S., Popescu Viadoianu O., Sprinceana V. "Procedeu de izolare a glicozidelor cardiotonice din Digitalis lanata." //Патент Румынии № 57006, 1974

51. Milica S., Popescu Viadoianu O., Sprinceana V. "Procedeu de separare, purificare si cristalisare a lanatozidelor А, В si С din Digitalis lanata." //Патент Румынии №57742,1974

52. Pekic В., Slobodan M. Slavica P.,Slavica B. "High- performance liquid chromatography of some digitalis glycosides and their aglycones on chemically bonded phases.", //J. chromatogr, 268, 1983, p. 237- 244.

53. Pitra J., Reichelt J., Cekan Z. "Zpusob deleni smesi lanatosidu chromatografii na aktivnim uhli." //Авторское свидетельство ЧССР № 142413, 1971

54. Pitra J., Sterva J., Kolarova H. et al. "Zpusob zpracovani koncentratu glycosidu naprstniku". //Авторское свидетельство ЧССР №231299, 1987

55. Sterva J.,Pitra J., "Zpusob izolace lanatosidu А." //Авторское свидетельство ЧССР №260701, 1989

56. Szeleczky Z., Tomorkeny E., Szarvady В., Dobo G., Farcas J., Bata K. "Eljaras digoxin tisztitasara es elkulonitesere." //Патент ВНР № 188300, 1984

57. Szeleczky Z., Tomorkeny E., Szentirmai A. "Eljaras lanatosid С es szarmazekai keverekekbol torteno kinyeresere, illetve dusitasara." //Патент ВНР № 181880, 1985

58. Tyihak E., Tetenyi P., Pallos L. at al. "Eljaras a digitalis lanata szivglukozidjainak a szetvalasztasara es egy vagy tobb komponens tiszta alakban torteno kinyeresere"//Патент BHP№ 185302, 1987

59. Wiegrebe H. and Wichtl M., "High- performance liquid chromatographic determination of cardenolides in Digitalis leaves after solid- phase extraction." //J. chromatogr, 630, 1993, p. 402- 407.

60. Wiegrebe H. and Wichtl M., "Zur bestimmung von cardenoliden aus gewebeculturen von digitalis- arten" //J. chromatogr, 234, 1982, S. 437-442,

61. Wolf L., Dancsi L., Koch L. "Eljaras a friss digitalis lanata novenybol kapott nyers vizes glikozidoldatok tisztitasara." //Патент ВНР №183223, 1986

62. Wyrzykowska В., Banek M., Wojtczak S., Tucholski K., Tobiasz W. "Sposob otrzymywania digoksyny z lisci naparstnicy welnistej." //Патент ПНР № 143815,1990

63. Wyrzykowska В., Michalak D., Tucholski K., Kurek Z. "Sposob wydzielanja kompleksu lanatozydow ABC z zanieczyszczonych roztworow wodnych."// Патент ПНР № 138386, 1988

64. Zurkowska J., Adamiec A. "Oznaczane aktywnostci digilanidazowej za pomoca naturalnych substratow"// Herba Pol., 21, №3, 1975, s. 247-283.

65. Zyner M., Kurek Z., Sienkiewicz- Wraga M. "Sposob usuwania balastow roslinnych z metanolowych ekstraktow w procesie wyodrebniania kompleksu lanatozydow ABC z lisci naparstnicy welnistej." //Патент ПНР № 78425, 1975